دانلود پروژه تكوین یك روش گاز كروماتوگرافی انتخابی جهت تعیین مقدار آمانتادین در مایعات بیولوژیك – قسمت چهارم

دانلود پایان نامه

این روش تكرار پذیری كمی‌ داشت و اكثر نمونه ها در مرحله آماده سازی بر اثر افزودن سود كوآگوله شده و تشكیل یك فاز را می‌ دادند كه جدا كردن فاز آلی و مایی و ممكن نبود در نتیجه ادامه آزمایش را بر روی آن نمونه غیر عملی می‌ نمود .

8 ـ در مطالعه دیگری كه توسط Rakstraw D. در سال 1993 انجام شد روشی برای اندازه گیری آمانتادین در پلاسما به وسیله دستگاه گاز كروماتوگراف ارائه شد . در این روش با استفاده از مشتق سازپنتا فلوروبنزوئیل كلراید مشتق مناسبی برای دتكتور Ni electron – capture تهیه شد . آمانتادین و استاندارد داخلی ( ریمانتادین ) ، در محیط بازی با تولوئن استخراج شدند . هر دو ماده با مشتق ساز ، مشتق سازی شده به ستون كاپیلر Hp-1 در دمای cْ180 تزریق شدند . حد تشخیص در این روش 3/2 نانگرم در میلی لیتر بود . ( 21 )

نکته مهم : برای استفاده از متن کامل تحقیق یا مقاله می توانید فایل ارجینال آن را از پایین صفحه دانلود کنید. سایت ما حاوی تعداد بسیار زیادی مقاله و تحقیق دانشگاهی در رشته های مختلف است که می توانید آن ها را به رایگان دانلود کنید

3 ـ 3 ـ طراحی روش GC جهت آنالیز آمانتادین در پلاسما

1 ـ 3 ـ 3 ـ ستون

1 ـ 1 ـ 3 ـ 3 ـ نوع ستون

به منظور بدست آوردن روشی با حداكثر جداسازی و زمان بازداری مطلوب از ستون‌های Capillar و Packed استفاده شد . ستون های Packed شامل : Carbowax ( قطبی) ، OV-17 ( نیمه قطبی ) ، OV – 101 ( غیر قطبی ) ، 1 ـ OV ( غیر قطبی ترین ) و ستون كاپیلر DB – 1701 ( نیمه قطبی ) آزمایش شدند .

بهترین جداسازی با ستون OV – 17 بدست آمد .

2 ـ 1 ـ 3 ـ 3 ـ دمای ستون

در این روش و دمای ستون با استفاده از برنامه ریزی دمایی تنظیم گشت . بطوریكه پس از آزمون های مكرر در دمای اولیه ستون 100 به مدت 5 دقیقه انتخاب گشت بعد از این مدت دما با سرعت 10 درجه در دقیقه تا رسیدن به دمای 130 بالا رفت و 2 دقیقه در این دما ماند سپس با سرعت 10 درجه در دقیقه به دمای 200 رسید .

2 ـ 3 ـ 3 ـ انتخاب استاندارد داخلی

سیكلوهگزیل آمین ، نقتیل آمین ، ایمی‌ پرامین و پسودوافدرین آزمایش شدند كه با توجه به زمان بازداری و عدم تداخل با مواد آندوژن پسودوافدرین به عنوان مناسب ترین استاندارد داخلی انتخاب گشت.

3 – 3 ـ 3 ـ حلال استخراجی

حلالهای كلروفرم ، هگزان و دی اتیل اتر مورد بررسی قرار گرفتند . كه با توجه به میزان بازیافت و نیز انتخاب پذیری بهترین نتایج با دی اتیل اتر بدست آمد .

4 ـ 3 ـ 3 ـ آماده سازی نمونه های سرمی‌

1-4-3-3- خصوصیات خون و انواع روشهای استخراج

با توجه به اهمیت بسیار بالای استخراج دارو از مایعات زیستی (خون، پلاسما یا سرم و ادرار) ، لذا ابتدا مختصری راجع به این مایع زیستی (خون) و انواع روشهای استخراج توضیح داده می شود و یك مقایسه نسبی نیز بین این روشها و مزایا و معایب آنها نسبت به هم ارائه می گردد.

خون پیچیده ترین مایع زیستی است كه پس از دریافت از انسان و یا حیوان به صورت مایعی شفاف و بافر شده محتوی پروتئین های محلول، چربیها و نمك های محلول در آب و سلول های معلق می باشد. خوشبختانه جزء اصلی خون یعنی گلبولهای قرمز یا ارپترویست ها به سادگی از محلول شفاف یا پلاسما توسط سانتریفوژ كردن قابل جداسازی است، معهذا در صورت عدم دقت در عملكرد با خون سلولها می توانند شكسته شده و روش عملی جداسازی بسیار پیچیده گردد.

به طور كلی هیچگاه خون به طور مستقیم استخراج نشده، بلكه ابتدا همیشه سرم یا پلاسما تهیه و سپس بقیه عملیات بر روی آنها صورت می پذیرد، در صورتیكه مستقیم از خون صورت پذیرد باید تدابیر لازم جهت اجتناب از پارگی سلولهای قرمز اتخاذ گردد.

از خصوصیات اصلی سرم و پلاسما وجود مقادیر بالایی از پروتئین ها در آنان است كه خود پروتئین ها از نظر خصوصیات فیزیكی و شیمیایی با مولكول كوچك دارو بسیار متفاوتند و این موضوع اهمیت بیشتر جداسازی را روشن می‌ سازد . به طور كلی هدف اصلی استخراج حدااكثر مقدار دارو و باقی گذاشتن مواد ناخواسته و مزاحم می‌ باشد.(8)

جهت استخراج دارو از سرم یا پلاسما روشهای مختلفی وجود دارد ، كه می‌ توان از روشهای ذیل نام برد :

1 ـ صاف نمودن ذرات بسیار ریز ( ultrafiltration )

2 ـ دیالیز

3 ـ رسوب دادن پروتئین ها

4 ـ استفاده از آنزیم های تجزیه كننده پروتئین ها

5 ـ استخراج توسط 2 تا 3 حجم از حلال آلی

6 ـ به كار بردن كارتریج و رزین های تعویض یونی

هر كدام از این روشها نسبت به هم مزایا و معایبی دارند كه بصورت خلاصه اشاره می‌ شود :

1 و 2 روش صاف نمودن ذرات ریز و دیالیز ، از مزایای آنها سریع بودن و یك مرحله ای بودن روش می‌ باشد، از طرف دیگر هر گونه اندازه گیری مستقیم مقدار دارو می‌ تواند مقدار كل داروی موجود را نادیده گرفته و فقط می‌زان داروی آزاد را تعین نماید . این روش در جداسازی داروی آزاد از داروی مزدوج با پروئین ، هر روزه بیشتر مورد توجه قرار می‌ گیرد . این عمل به كمك صافی های مخصوصی مانند ورتینگتون و آمیكون قابل انجام است . به هر صورت باید توجه داشت چنین مقادیر بسیار پائینی كه برای داروهای آزاد وجود دارد عموماً خارج از حد آشكارسازی تجزیه ای می‌ باشند ، به همین جهت تعیین مقدار كل دارد در پلاسما و سرم معمول می‌ باشد . ( 8 )

3 ـ ساده ترین و قدیمی‌ ترین روش رسوب دادن پروتئین و جداسازی محلول از آن است . پروتئین در اثر رسوب دادن تغییر ماهیت داده و اتصال آن با دارو گسسته می‌‌شود. به نحوی كه به احتمال زیاد دارو در محلول باقی خواهد ماند . از معرفهای اسیدی كه جهت رسوب دادن پروتئین طرفدار دارند می‌ توان اسید تری كلرواستیك ، اسید پركلریك و اسید تنگستیك را نام برد . كلرورآلومینیوم هم روش مطمئنی جهت رسوب دادن پروتئین ها در نمونه خون كامل می‌ باشد . اخیراً حلالی با قطبیت بالا مثل استونیتریل خصوصاً در مواردی كه مرحله بعدی استفاده از كروماتوگرافی با كارایی بالاست مورد توجه قرار گرفته است . ( 18 )

جدول ( 1 ـ 3 ) تغییر ماهیت و رسوب دادن پروتئین های سرم یا پلاسما قبل از اقدام به تجزیه دارو

روش ملاحظات
حرارت دادن در 90 درجه سانتیگراد به مدت 15 ـ 5 دقیقه روش نامناسب ، ممكن است ماده را تجزیه نماید
انجماد ، ذوب مكرر روش نامناسب و وقت گیر
سولفات روی / سود راندمان عالی ، رسوب های ریز ، pH نهایی تقریباً 7 مناسب در درجه حرارت های پائین
اسید پركلریك راندمان عالی ، معرف باید سرد نگاه داشته شود ، 3PH< نهایی ممكن است نمونه را تجزیه نماید ، خطر انفجار ، اغلب تركیبات قلیایی قابل استخراج با بازدهی بالا هستند .
اسید تری كلرواستیك راندمان خوب ، معرف سرد نگاه داششته شود ، خارج كردن نمونه مورد تجزیه ممكن است مشكل شود .
استونیتریل 5/1 حجم برای تغییر ماهیت كامل پروتئین ، فلوكهای گسسته رسوب دارو را به همراه پروتئین بسیار   كاهش می‌ دهد ، مخصوصاً مناسب برای HPLC در مرحله بعد
آلومینیوم كلرید برای تركیبات قلیائی از سولفات آمونیوم یا اسید تنگستیك بهتر می‌ باشد .

4 ـ پروئین ها را می‌ توان با استفاده از آنزیم های تجزیه كنندة پروتئین تغییر ماهیت داد . هر چند این قبیل آنزیم ها بیشتر در آماده سازی بافتها جهت تجزیه استفاده می‌ شود ، در این راستا آنزیم سوبتیلیسین جهت هضم پروتئین های پلاسما با موفقیت به كار گرفته شده است . ( 8 )

5 ـ اگر چه داروها می‌ توانند اتصال شدید با پروتئین های پلاسما برقرار نمایند اما این فرایند بازگشتنی است و در pH های مناسب ماده مورد نظر می‌ تواند توسط حلال آلی استخراج گردد . اگر می‌زان تفكیك به داخل فاز آلی برای صورت غیر یونیزه دارو بالا باشد ، تعادل مزدوج شدن با پروتئین ، به نحوی كه استخراج موثر به داخل فاز آلی را ممكن سازد به مقدار كافی قابل تغییر است . روش عملكرد افزودن حجم مساوی از بافر مناسب به نمونه استخراج توسط 2 تا 3 حجم از حلال آلی است . برتری این روش حذف مرحله صاف كردن و جداسازی فاز مایع بوده و همچنین امكان بكارگیری آن در تجزیه های پی در پی تعداد زیادی نمونه است . و این یك خواست رو به افزایش در آزمایشگاه هایی است كه تجزیه كمی‌ داروها در مایعات زیستی را انجام می‌‌دهند .

6 ـ یكی دیگر از روشهای ساده ، افزودن نمونه خام به ستونی از ماده جاذب جهت تغلیظ دارو كه سپس توسط حلال آلی شسته می‌ شود ، پیشنهاد شده است . مواد جاذب به كار گرفته شده می‌ باید قدرت كافی جداسازی تمام دارو از پروتئین را داشته و در عین حال از ملایمت مناسب كه امكان رها شدن دارو در مرحله شستشو با فاز آلی را فراهم سازد ، برخوردار باشد . از كربن فعال شده به صورت افزودن مستقیم آن به نمونه و یا با استفاده از روش ستونی ، بدین منظور استفاده شده است .

كاربرد رزینهایی مانند xAD-2 و 3 x 6 و نظایر آنها از قبیل فازهای ثابت بكار گرفته شده در كروماتوگرافی مایع با كارایی بالا مانند سلیكا متصل به هیدروكربور 18 كربنه كه به صورت كارتریج در بازار موجودند ، نیز بسیار معمول گردیده است . ( 8 )

پس از رسوب پروتئین نمونه های سرمی‌ ها به روش های ذكر شده در بالا می‌ توان یا مستقیماً از نمونه بدست آمده به دستگاه تزریق نمود و یا از روش استخراج مایع ـ مایع استفاده نمود ، مزیت این روش این است كه در نهایت با كاهش حجم نمونه و افزایش غلظت همراه است كه برای غلظت های كم نمونه در محیط های بیولوژیك بسیار مفید است .

به طور كلی هدف اصلی استخراج ورود حداكثر مقدار دارو به فاز آلی ( حداكثر بازیافت‌) و باقی گذاشتن مواد ناخواسته و مزاحم است ( انتخاب پذیری ) : این هدف غالباً توسط مجموعه‌ای از اقداماتی چون تنظیم pH و یا قطبیت حلال آلی قابل حصول است .

جهت بالا بردن راندمان استخراج پیشنهاد می‌ شود تعداد دفعات استخراج با فاز آلی را بالا برده و در نهایت برای كاهش حجم نمونه از روش خشك كردن نمونه و تنظیم حجم با فاز متحرك استفاده شود .

2 ـ 4 ـ 3 ـ 3 ـ روش مورد استفاده در آزمایش

آماده سازی نمونه های سرمی‌ به روش رسوب پروتئیـن و سپس استخراج صورت گرفت .

مواد بكار برده شده جهت ترسیب عبارت بودند از :

1 ـ استونیتریل

2 ـ سولفات روی 7/0 مولار / سود 2 مولار

3 ـ اسید پركلریك 35%

روش اول به دلیل حلالیت كم آمانتادین در استونیتریل مناسب نبود .

در روش دوم احتمال یك فاز شدن نمونه های پلاسمایی بالا بود و از طرفی آمانتادین هیدروكلراید در حضور سود به آمانتادین ( صورت بازی آن ) تبدیل می‌ شد و احتمال رسوب آن همراه پروتئین ها و وارد نشدن به فاز مایی بالا بود .

در نهایت از اسید پركلریك جهت رسوب پروتئین ها استفاه شد . در این روش به 2 میلی لیتر نمونه سرمی‌ 5/0 میلی لیتر اسید پركلریك اضافه شد و بعد با سرعت rpm 4000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد .

پس از رسوب پروتئین توسط اسید پركلریك استخراج آمانتادین از فازمایی توسط دی اتیل اتر تقطیر شده انجام گرفت كه در بخش ( 3 ـ 4 ـ 3 ) ذكر می‌ شود .

4 ـ 3 ـ تعیین مقدار آمانتادین هیدروكلراید در سرم

1 ـ 4 ـ 3 دستگاهها ، وسایل و مواد مورد نیاز

1 ـ 1 ـ 4 ـ 3 ـ دستگاهها و وسایل مورد نیاز

دستگاه                                       مدل                                 شركت

– سانتریفوژ                              Z 200A                          HERMLE

– ورتكس                                     –                              HEIDOLPH

  • GC با مدل 8700 ساخت شركت PERKIN – ELMER متشكل از
  • ستون پر شده 3%OV17 on chromosorb WHP 100/120-2m tmax = 350
  • دتكتور FID

2 ـ 1 ـ 4 ـ 3 ـ مواد مورد نیاز

  • دی اتیل اتر ( Merck . Art 00926 )
  • ایزوپروپیل الكل ( Merck . Art 995 )
  • پودر آمانتادین هیدروكلراید شركت تولیددارو
  • پودر پسودوافدرین هیدروكلراید كشور هند بچ نامبر 123-02-02-pEH
  • هیدروكسید سدیم (Merck . Art 106 )
  • اسید پركلریك

برای دیدن قسمت های دیگر این تحقیق لطفا” از منوی جستجوی سایت که در قسمت بالا قرار دارد استفاده کنید. یا از منوی سایت، فایل های دسته بندی رشته مورد نظر خود را ببینید.

با فرمت ورد

Leave a comment