پایان نامه و مقاله

  فهرست مطالب
  فصل اول: مقدمه
1 1-1- معرفی ویروس بی بذزی گوجه فرنگی
1 1-2- بررسی دامنه میزبان­های طبیعی و علائم ویروس بی بذری گوجه فرنگی
2 1-2-1- میز بان­های اولیه
2 1-2-1-1-گل داوودی
2 1-2-1-1-1- علائم ویروس بی بذزی گوجه فرنگی بر روی گیاه داوودی
3 1-2-1-1-2- دیگر ویروس های داوودی
3 1-2-1-2- گیاه گوجه فرنگی
3 1-2-1-2-1- علائم ویروس بی بذری گوجه فرنگی بر روی گیاه گوجه فرنگی
4 1-2-1-2-2- دیگر ویروس های گوجه فرنگی
4 1-2-2- میزبان های ثانویه ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
4 1-2-2-1- خانواده Compositae
4 1-2-2-1-1-گل آهار
4 1-2-2-2- خانواده Solanaceae
4 1-2-2-2-1-گیاه فلفل
5 1-2-2-3- خانواده Iridaceae
5 1-2-2-3-1- گل گلایول
5 -2-2-3-2- گل سنبل
6 1-2-2-4- خانواده Tropaeolaceae
6 1-2-2-4-1- گل لادن
6 1-2-2-5- خانواده Cannaceae
6 1-2-2-5-1- گل اختر
7 1-2-2-6- خانواده Liliaceae
7 1-2-2-6-1- گل سوسن
7 1-2-2-7- خانواده Lamiaceae
7 1-2-2-7-1- گیاه نعناع
7 1-2-2-8- خانواده Leguminosae
7 1-2-2-8-1- گیاه لوبیا
8 1-2-2-9- خانواده Chenopodiaceae
8 1-2-2-9-1- گیاه اسفناج
8 1-2-2-10- خانواده Campanulaceae
8 1-2-2-3-10- گل استکانی
9 1-3- اهداف تحقیق
   
  فصل دوم: مروری برمنابع
10 2-1- جایگاه ویروس بی بذری گوجه فرنگی در طبقه بندی ویروس­های گیاهی
10 2-2- جنس کوکوموویروس
10 2-2-1- ویژگی های ویریون
11 2-2-2- ویژگی های ژنو
12 2-2-3- عملکرد پروتئین ها در جنس کوکوموویروس
12 2-2-3-1- پروتئین 1a
12 2-2-3-2- پروتئین 2a
13 2-2-3-3- پروتئین 2b
14 2-2-3-4- پروتئین 3a
14 2-2-3-5- پروتئین پوششی (CP)
15 2-3- ویروس بی­بذری گوجه فرنگی در جهان
16 2-3-1- سازماندهی ژنوم ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
16 2-3-2- آر.ان.ای­های ژنومی
16 2-3-2-1- قطعه RNA-1
17 2-3-2-2- قطعه RNA-2
18 2-3-2-3- قطعه RNA-3
18 2-3-3- آر.ان.ای­های زیر­ژنومی
19 2-4- دامنه میزبانی و علائم ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
19 2-4-1- دامنه میزبانی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی بر روی گیاهان آزمون
19 2-4-2- گیاهان تشخیصی ویروس ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
20 2-4-3-گیاهان تکثیری ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
20 2-5- تفاوت­های ویروس بی­بذری گوجه فرنگی و ویروس موزائیک خیار
21 2-6 – روش­های انتقال ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
21 2-6-1- انتقال با حشره ناقل
21 2-6-2- انتقال با بذر
21 2-6-3- انتقال با سس
21 2-7- سرولوژی
22 2-8- ویژگی های فیزیکی و فیزیوشیمیایی
22 2-9- مکانیزم ایجاد بی بذری توسط ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
23 2-10- زیان های اقتصادی توسط ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
23 2-11- نقش پروتئین حرکتی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی در بروز علائم
24 2-12- نقش پروتئین پوششی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی در ایجاد آلودگی سیستمیک در گیاه
25 2-13- هیستولوژی
   
  فصل سوم: مواد و روش­ها
26 3-1- نمونه برداری
26 3-2- آزمون الایزا
26 3-2-1- مراحل الایزای ساندویچ دو طرفه
27 3-2-2- بافرهای مورد استفاده در آزمون های الایزا
29 3-3- تعیین دامنه میزبانی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی و مطالعات گلخانه ای
29 3-3-1- بافر فسفات 1/0 مولار 7 pH=
30 3-4- مطالعات مولکولی
30 3-4 -1- استخراج Total RNA با استفاده از کیت High pure viral nucleic acid kit
31 3-4-2- آزمون واکنش زنجیره ای پلیمراز به روش نسخه برداری معکوس
31 3-4-2-1- مرحله سنتز cDNA
32 3-4-2-2- مراحل آزمون PCR
32 3-4-3- آغازگرهای اختصاصی مورد استفاده جهت تکثیر ژنوم جدایه ایرانی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
32 3-4-4- الکتروفورزافقی
33 3-4-4-1- مواد لازم جهت تهیه بافر TBE
33 3-4-4-2- آماده سازی نشانگر مولکولی
33 3-5- همسانه سازی و تعیین توالی قطعات مختلف ژنوم جدایه ایرانی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی مجزا شده از گیاه اطلسی (Ker.Mah.P) و ژن پروتئین پوششی جدایه مجزا شده از گیاه داوودی (Ker.Ker.Ch.1)
34 3-5-1- قراردادن قطعه DNA موردنظر درون ناقل (Ligation)
34 3-5-1-1- خالص سازی محصول پی.سی.آر با استفاده از کیت (High Pure PCR Product Purification Kit)
34 3-5-1-2- استخراج از ژل با استفاده از کیت Agarose Gel DNA Extraction Kit
35 3-5-2- مراحل آماده سازی باکتری جهت عمل ترنسفورماسیون (Transformation)
35 3-5-2-1- کشت باکتری Escherichia coli بر روی محیط کشت جامد (Luria Bertani)  LB
36 3-5-2-2-کشت باکتری E.coli در محیط مایع C-medium
36 3-5-2-3- تهیه سلول های مستعد (competent cell) باکتری E.coli
37 3-5-3- انتقال پلاسمید نوترکیب به درون باکتری E.coli (Transformation)
37 3-5-4- محیط کشت جامد حاوی آمپی سیلین، IPTG و X-gal
38 3-5-5- انتخاب پرگنه جهت استخراج پلاسمید نوترکیب
38 3-5-6- استخراج پلاسمید نوترکیب از باکتری توسط روش Boiling:
39 3-5-7- استخراج پلاسمید نوترکیب از باکتری توسط High Pure Plasmid Isolation Kit,
40 3-5-7-1- مواد تشکیل دهنده بافرهای استفاده شده در استخراج پلاسمید
40 3-5-8- هضم آنزیمی پلاسمید (Digestion)
41 3-5-9- انجام الکتروفورز جهت بررسی صحت انجام عمل هضم آنزیمی پلاسمید و همسانه سازی
41 3-6- نگهداری باکتری حاوی پلاسمید نوترکیب
41 3-7- آماده سازی نمونه ها به منظورتعیین توالی نوکلئوتیدی
41 3-8- تعیین ترادف ژنوم کامل جدایه ایرانی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی مجزا شده از گیاه اطلسی (Ker.Mah.P) و ژن پروتئین پوششی جدایه مجزا شده از گیاه داوودی (Ker.Ker.Ch.1) و مقایسه آن­ها با سایر جدایه های موجود در بانک ژن
   
  فصل چهارم: نتایج
43 4-1- شناسایی و معرفی ویروس بی بذری گوجه فرنگی در ایران
43 4-1-1- علائم جدایه های شناسایی شده
43 4-1-1-1- جدایه اطلسی (Ker.Mah.P)
43 4-1-1-2- جدایه داوودی (Ker.Ker.Ch.1)
44 4-2- تعیین دامنه میزبانی جدایه­های ایرانی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
44 4-2-1- بررسی علایم ایجاد شده بر روی گیاهان مایه زنی شده خانواده Solanaceae
44 4-2-1-1- علائم ایجاد شده بر روی میزبان های طبیعی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
44 4-2-1-1-1-گیاه گوجه فرنگی
44 4-2-1-1-2- گیاه فلفل
45 4-2-1-1-3- گل اطلسی
45 4-2-1-2- علائم بر روی میزبان های آزمایشگاهی ویروس در خانواده Solanaceae
45 4-2-1-2-1- گیاه توتون Nicotiana glutinosa L.
45 4-2-1-2-2- گیاه توتون Nicotiana Clevelendii Gray.
46 4-2-1-2-3- گیاه توتون Nicotiana tabacum L. cv. Whiteburly
46 4-2-1-2-4- گیاه توتون Nicotiana debneyii L.
46 4-2-1-2-5- گیاه توتون Nicotiana tabacum var Samsun NN.
46 4-2-1-2-6- گیاه توتون Nicotiana tabacum L. cv. Turkish
46 4-2-1-2-7- گیاه داتوره.Datura maxima L
47 4-2-1-2-8-گیاه داتوره.Datura stramonium L
47 4-2-2- بررسی علایم ایجاد شده بر روی گیاهان مایه زنی شده خانواده Compositaeae
47 4-2-2-1- گل داوودی
47 4-2-2-2- گل آهار
48 4-2-2-3- گل آفتابگردان زینتی
48 4-2-3- بررسی علایم ایجاد شده بر روی گیاهان مایه زنی شده خانواده Chenopodiaceae
48 4-2-3-1- گونه­های کنوپودییوم
48 4-2-3-2- گیاه اسفناج
48 4-2-4- بررسی علایم ایجاد شده بر روی گیاهان مایه زنی شده خانواده Cucurbitaceae
49 4-2-4-1- گیاه خیار رقم Peto Seed
49 4-2-5- بررسی علایم ایجاد شده بر روی گیاهان مایه زنی شده خانواده Leguminosae
49 4-2-5-1- گیاه لوبیا چشم بلبلی رقم مشهد
49 4-2-5-2- گیاه لوبیا سبز رقم Sunrise
49 4-3- استخراج Total RNA و آزمون RT-PCR
50 4-4- همسانه سازی قطعات تکثیر شده ژنوم جدایه های ایرانی ویروس بی بذری گوجه فرنگی
51 4-5- تعیین ترادف طول کامل ژنوم جدایه Ker.Mah.P و تعیین جایگاه تکاملی جدایه­های ایرانی ویروس بی­ بذری گوجه فرنگی
   
  فصل پنجم: بحث
52 5-1- بحث
60 منابع مورد استفاده

– معرفی ویروس بی بذزی گوجه فرنگی

ویروس بی بذری گوجه فرنگی[1] ویروسی است از خانواده بروموویریده[2] و جنس کوکوموویروس[3] که برای نخستین بار در سال 1939 توسط Ainsworth از روی گیاه داوودی و در سال 1949 از روی گیاه گوجه فرنگی توسط Blencowe و Caldwell گزارش گردید. ویروس بی بذری گوجه فرنگی گسترش جهانی داشته و در کشت­های داوودی ایجاد آلودگی نموده در حالیکه در کشت های گوجه فرنگی کمتر یافت می گردد (Hollings & Stone, 1970). پیکره­ها­ی TAV ایزومتریک به قطر حدودا 30 نانومتر و ژنوم ویروس متشکل از سه قطعه آر.ان.ای تک رشته ای[4] مثبت و چهار قطعه آر.ان.ای زیر ژنومی[5] می باشد (Shi et al., 1997). هر یک از قطعات کد کننده پروتئین های متفاوتی­اند. RNA-1 دارای یک ORF[6] بوده که پروتئین 1a راکد می نماید. RNA-2 و RNA-3 هر کدام دارای دو ORF بوده و به ترتیب پروتئین های 2a، 2b، 3a و 3b را کد می­نمایند. این ویروس به راحتی توسط تعداد زیادی از گونه های شته خانواده آفیدیده[7] از جمله شته سبز هلو[8] به شیوه ناپایا منتقل می­گردد. همچنین این ویروس از طریق مایه زنی، پیوند و بذر هم قابل انتقال می­باشد (Raj et al.,2011; Hollings & Stone, 1970).

1-2- بررسی دامنه میزبان­های طبیعی و علائم ویروس بی بذری گوجه فرنگی

ویروس بی بذری گوجه فرنگی دارای دامنه میزبانی گسترده­ای می­باشد و گیاهان بسیاری را آلوده می­سازد. گیاهان داوودی و گوجه فرنگی میزبانان اولیه و اصلی TAV  محسوب می­گردند و این ویروس در گیاهان دیگری از قبیل آهار، سنبل، اختر، سوسن، گلایول، لادن، گل استکانی، لوبیا، فلفل، نعناع و اسفناج ایجاد بیماری می­نماید. در این تحقیق نیز گیاه اطلسی برای نخستین بار در دنیا به عنوان میزبان جدید ویروس TAV معرفی می­گردد (جدول 1-1).

1-2-1- میز بان های اولیه

1-2-1-1-گل داوودی[9]

داوودی مهمترین گل شاخه بریده[10] دنیا می باشد که به دلیل گل­های زیبا در رنگ، شکل و اندازه­های متنوع مورد توجه می­باشد. این گیاه از خانواده کمپوزیته[11] و بومی آسیا و کشور چین بوده که بیش از 200 گونه دارد. در بین گونه­ها ارقام یکساله، چند ساله و درختچه­های کوچک و بوته ای وجود دارند. گل­های بریده داوودی، عمر گلدانی بیشتری نسبت به سایر گل­های بریده دارند که دلیل آن را تولید کم اتیلن در طی پیری می دانند. داوودی از طریق قلمه، تقسیم بوته و بذر ازدیاد می گردد که در بین این روش ها متداول ترین روش افزایش از طریق قلمه ها می باشد (قاسمی و کافی، 1384).

گیاه داوودی میزبان اصلی ویروس TAV محسوب می­گردد و این ویروس نیز مهمترین عامل خسارت­زای این گیاه در دنیا می­باشد (Choi et al.,2001). بعد از اولین گزارش

یک مطلب دیگر :

نمایش مشخصات: سئو

 در مورد آلودگی گل­های داوودی توسط ویروس TAV (1939) این ویروس از نقاط مختلف کشت های داوودی در دنیا گزارش گردیده است (Hollings & Stone, 1970). مهمترین زیان وارده توسط TAV در این گیاه بدشکلی و نابودی گل و گلبرگ ها می­باشد (Raj et al., 2009).

1-2-1-1-1 علائم ویروس ویروس بی بذری گوجه فرنگی بر روی گیاه داوودی

مهمترین علائم ایجاد شده توسط TAV بر روی گیاه داوودی شامل کاهش اندازه و رشد، ظاهر نامنظم یا بدشکل، ابلقی شدن برگ ها، لوله ای شدن و شکستگی رنگ یا رنگ پریدگی گلبرگ ها می باشد. علائم در گل ها متفاوت می باشد و آلودگی در فصل اول تنها بخشی از گل ها را تحت تاثیر قرار داده، اما در فصول بعدی تقریباً تمامی گل ها علائم شدیدتری را نشان می دهند (شکل های 1-1 و 1-2). این ویروس نه تنها بین واریته ها و گیاهان مختلف همان واریته، بلکه بین قلمه های حاصل از یک پایه و گل های روی یک گیاه نیز علائم متفاوتی ایجاد می نماید. بعلاوه اینکه ویروس TAV علائم تولید شده توسط سایر ویروس های داوودی را نیز تشدید می­کند (Hollings & Stone, 1970).

1-2-1-1-2– دیگر ویروس های داوودی

تا کنون به جز TAV پانزده ویروس دیگر نیز به عنوان ویروس های آلوده کننده گیاه داوودی معرفی گردیده اند که از آن جمله می توان به ویروس های Chrysanthemum B carlavirus (CVB) (Wilson and Moran, 1983)، Potato virus X (PVX) (Navalinskiene & Samuitiene, 1996)،Tomato ringspot virus (TRSV)، Tomato spotted wilt virus (TSWV) (Verhoeven et al., 1996)، Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV)، Cucumber mosaic virus (CMV)، Chrysanthemum vein chlorosis rhabdovirus (CVCV)، Impatiens necrotic spot tospovirus (INSV)، اشاره نمود.

1-2-1-2- گیاه گوجه فرنگی[12]

گوجه ‌فرنگى ابتدا به ‌عنوان گیاه زینتى در باغچه ‌ها مورد استفاده قرار گرفت و به نام سیب طلایى معروف گردید. این گیاه عضو خانواده سولاناسه[13] بوده و بومی آمریکای جنوبی می باشد. گوجه فرنگی به علّت دارا بودن ویتامین‌هایA ، B، C،K  و مواد معدنی مانند کلسیم، فسفر و آهن در تأمین انرژی و تقویت بدن نقش موثری ایفاء می ‌کند (پیوست، 1388). از جمله روش های تکثیر گوجه فرنگی استفاده از بذر بوده (پیوست، 1388) که ویروس TAV به دلیل ایجاد بی بذری و کاهش تولید میوه در این گیاه مورد توجه می باشد (Hollings & Stone, 1970)

1-2-1-2-1– علائم ویروس بی بذری گوجه فرنگی بر روی گیاه گوجه فرنگی

ویروس TAV در سال 1949 با علائم کاهش رشد، کوتولگی و ایجاد میوه های بدون بذر از روی گیاه گوجه فرنگی توصیف گردیده است (Blencowe & Caldwell, 1949). در گوجه فرنگی علائم به شکل های متفاوتی از جمله بد شکلی، عدم تقارن، پیچیدگی برگ ها،کوتولگی گیاه و ممانعت از رشد انتهایی که منجر به بوته ای شدن (جارویی شدن) غیر طبیعی می گردد را شامل می شود. گل ها اغلب تعداد اندکی میوه تولید نموده که بدون بذر می باشند (Hollings & Stone, 1970).

1-2-1-2-2- دیگر ویروس های گوجه فرنگی

از دیگر ویروس های آلوده کننده ی گوجه فرنگی می توان به ویروس های Potato virus Y (PVY) (Aramburu et al., 2006) ، Cucumber mosaic virus (CMV) (Garcia-Arenal et al., 2000)، Tomato mosaic virus (ToMV) (Zitter & Tasi, 1981)، Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Polston et al., 1999)، Tomato spotted wilt virus (TSWV) (Williams et al., 2001)، اشاره نمود.

1-2-2- میزبان های ثانویه ویروس بی­بذری گوجه فرنگی

1-2-2-1- خانواده Compositae

1-2-2-1-1- گل آهار[14]

گیاه آهار به عنوان میزبان ثانویه ویروس TAV از کشورهای انگلستان و ژاپن معرفی گردیده است (Hollings, 1955; Kameya-Iwaki et al., 1996). موطن اصلی این گیاه مکزیک
می باشد. گل آهار یکساله با برگ های نسبتا پهن، دراز و نوک تیز، دارای انواع گل های کم پر و پر پر، گل های درشت و گل های ریز با رنگ های متنوع می باشد. ویروس TAV شبیه به ویروس موزائیک توتون و ویروس موزائیک شلغم باعث ایجاد لکه های کلروتیک و موزائیک بر روی برگ های گل آهار می گردد (Kameya-Iwaki et al., 1996).

1-2-2-2- خانواده Solanaceae

1-2-2-2-1-گیاه فلفل[15]

فلفل بومی مکزیک، جنوب پرو و بولیوی می باشد و در سراسر جهان تحت شرایط محیطی و آب و هوایی مختلف رشد می کند (پیوست، 1388). TAV از جمله ویروس های آلوده کننده ی فلفل می باشد که ازکشور های مختلف دنیا ازجمله ژاپن، مجارستان، هلند و نیوزیلند گزارش گردیده است.علائم ویروس TAV بر روی فلفل شامل ابلقی، کلروز، موزائیک، تاولی و بد شکلی در برگ ها و تولید گل ها و میوه های بدون بذر می باشد. همچنین از دیگر علائم ویروس بر روی فلفل می توان به علائم موسوم به Calico (ابلقی زرد) در برگ ها اشاره نمود .(Salamon et al., 1976; Procter 1975)

1-2-2-3- خانواده Iridaceae

1-2-2-3-1- گل گلایول[16]

گلایول بومی آفریقا، نواحی مدیترانه ای و اروپا بوده و یکی از مهمترین گل های زینتی در دنیا می باشد (قاسمی و کافی، 1384). هند به عنوان یکی از مهمترین کشورهای تولید کننده این گل مطرح می باشد و در موسسه ی ملی تحقیقات گیاهی این کشور 125 رقم گلایول نگهداری می گردد (Raj et al. 2002). تاکنون ویروس های متعددی به عنوان ویروس آلوده کننده ی گلایول از کشور هند معرفی گردیده اند که از جمله می توان به ویروس های، Tomato spotted wilt virus (Stein, 1995)، Tomato black ring spot virus،  Arabis mosaic virus، Tobacco streak virus، Tobacco ring spot virus (Katoch et al., 2004)، Bean yellow mosaic virus (Srivastava et al., 1983) و Cucumber mosaic virus (Raj et al., 2002) اشاره نمود. در سال 2011 گل گلایول به عنوان میزبان جدید ویروس TAV از کشور هند گزارش گردید که با وجود آلودگی پائین ویروس شدت علائم بالا بوده است. علائم TAV به صورت موزائیک شدید و ایجاد لکه های نکروتیک در امتداد رگبرگ ها می باشدکه در انتهای فصل سبب کوچکی و شکستگی رنگ گل در گلایول می گردد (شکل 1-3) (Raj et al. 2011).

1-2-2-3-2- گل سنبل[17]

دسته‌ها: Uncategorized

0 دیدگاه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *