سایت دانلود

تحقیق ها مقاله ها و پایان نامه ها
مهندسی کشاورزی

پروژه رشته کشاورزی درباره خانواده گلسرخیان – قسمت سوم

-7-1- چگونگي ايجاد ميكروستلايت‌ها

مهمترين عامل در توليد ريزماهواره‌ها موتاسيون در تعداد واحدهاي تكرار شونده از طريق عدم جفت‌شدن ناشي از لغزش در طول رشته[1] و يا خطاهاي همانند سازي DNA، عنوان شده است. گاهي DNA پلي‌مراز در طول همانندسازي در نواحي تكرار شونده سر مي‌خورد و باعث تغيير در تعداد واحد تكرار شونده مي‌شود. در حقيقت سرخوردن DNA پليمراز در طول نواحي تكراري باعث عدم جفت‌شدن كامل دو رشته DNA گشته و در نهايت حلقه‌هايي در رشته الگو يا رشته جديد ايجاد مي شود. اگر نتيجه همانندسازي ايجاد واحدهاي تكرارشونده اضافي باشد، حلقه در رشته جديد به وجود مي‌آيد ولي اگر نتيجه همانندسازي كاهش در واحدهاي تكرار شونده باشد، حلقه در رشته الگو تشكيل خواهد شد (12).

نکته مهم : برای استفاده از متن کامل تحقیق یا مقاله می توانید فایل ارجینال آن را از پایین صفحه   کنید. سایت ما حاوی تعداد بسیار زیادی مقاله و تحقیق دانشگاهی در رشته های مختلف است که می توانید آن ها را به رایگان   کنید

6-7-1- خصوصيات نشانگرهاي SSR

نشانگرهاي SSR خاص يك مكان ژني مي‌باشند و به صورت هم بارز توارث مي‌يابند. اين نشانگرها علاوه بر تنوع آللي بالايي كه نشان مي‌دهند، در كل ژنوم نيز پراكنده شده‌اند. اگرچه هزينه استفاده از اين نوع نشانگرها زياد است ولي به واسطه پتانسيل بالاي آنها در تشخيص پلي مورفيسم و هتروزيگوسيتي در گونه های موجودات زنده به فراواني استفاده مي شوند (17).  هر چند كه ريز ماهواره‌هاي هر موجودي اختصاصي است ولي توالي‌هاي احاطه‌كنده توالي‌هاي تكراري در گونه‌هاي خويشاوند حفظ شده مي‌باشد. از اينرو آغازگرهاي طراحي شده براي يك گونه قابل استفاده در گونه‌هاي خويشاوند هستند (10).  در SSR نيز مانند نشانگرهاي AFLP مي‌توان از فرايند چند تركيبي بهره برد. بدين ترتيب تكثير همزمان[2] مكانهاي ژني چند گانه در يك PCR صورت مي‌گيرد. چند تركيبي همچنين مي‌تواند به صورت تركيب قطعات آللي بيش از يك مكان ژني در يك چاهك الكتروفورز باشد (18).

7-7-1- كاربردهاي نشانگرهاي SSR

امروزه ريزماهواره‌ها به علت تعداد زياد و پراكنش اين توالي‌ها در ژنوم، يكي از نشانگرهاي مولكولي مفيد و سودمند در گونه‌هاي گياهي از جمله ذرت، سويا، براسيكاسه، برنج، جو، ارزن، گوجه، سورگوم و انواع درختان ميوه مانند سيب مي‌باشند (14).  مهمترين كاربرد   ريز ماهواره‌ها شامل مطالعه تنوع ژنتيكي و تكامل (10)، تهيه نقشه‌هاي ژنتيكي، مطالعات اكولوژيكي و تكامل جمعيت‌ها و گزينش به كمك نشانگر مي‌باشد   .(19)

8-7-1- مزاياي ریز ماهواره ها

1) فراواني در ژنوم و سطح بالاي تنوع آللي در مكان‌هاي ريزماهواره

2) توزيع تصادفي در سراسر ژنوم

3) توارث هم بارز

4) از آنجا كه هر نشانگر ريز ماهواره به منزله يك مکان ژني است، بنابراين هر نوار، يك مكان ژني به حساب مي‌آيد.  از اين خاصيت در مطالعات تكاملي و ژنتيك جمعيت و تجزيه‌هاي ژنتيكي استفاده مي‌شود.  همچنين برآورد اندازه آلل‌ها در يك مكان به كمك مدلهاي رگرسيوني و نيز فراواني آللي امكان‌پذير مي‌باشد(30,27,20 ,22, 23).

5)تکرار پذیری بالا بدلیل طول نسبتاً زياد آغازگرهاي ريزماهواره (25-15 نوكلئوتيدي) و اختصاصي بودن جايگاه اتصال آنها

6) با توجه به اينكه توالي‌هاي احاطه كننده واحدهاي تكراري در داخل گونه و حتي در گونه‌هاي داخلي جنس‌ها، حفظ شده‌اند، بنابراين اين نشانگرها از اهميت خاصي در مطالعات اكولوژيكي و فيلوژنتيكي برخوردارندو همچنين آغازگرهاي طراحي شده براي يك گونه قابل استفاده در گونه‌هاي خويشاوند هستند (24, 14,10)

7) در اين نشانگرها، مشكل همولوگ بودن نوارهاي هم اندازه كه در نشانگرهاي RAPD و AFLP اتفاق مي‌افتد، وجود ندارد (21).

8) اگرچه هزينه استفاده از اين نوع نشانگرها زياد است ولي به واسطه پتانسيل بالاي آنها در تشخيص پلي‌مورفيسم و هتروزيگويستي، به فراواني استفاده ميشود (17).

9) در SSR نيز مانند نشانگرهاي AFLP مي‌توان از فرآيند چند تركيبي بهره برد. بدين ترتيب که تكثير همزمان مكانهاي ژني چندگانه در يك PCR صورت مي‌گيرد. چند تركيبي همچنين مي‌تواند به صورت تركيب قطعات آللي بيش از يك مكان ژني در يك چاهك الكتروفورز باشد (18).

9-7-1- معايب ريز ماهواره‌ها

1) مشكل عمده ريزماهواره‌ها طراحي اوليه آغازگرهاي آنهاست كه بسيار پرهزينه و وقت‌گير است. شناسايي و طراحي اوليه آغازگرها، نياز به شناسايي توالي‌هاي تكراري در كروموزوم‌ها و توالي‌هاي احاطه‌كننده آنها و در نهايت توالي‌يابي دارد. از اينرو در گياهاني كه روي آنها كار نشده   است، بسيار هزينه‌بر مي‌باشد   .(25,  26)

2) گاهاً ممكن است به علت تكرار بيش از يك بار يك مكان خاص در ژنوم، امكان امتيازدهي همبارز الگوي نواري وجود نداشته باشد.

3) به علت ظهور نوارهاي Stutter كه به دليل سرخوردن[3] آنزيم Tag پليمراز در هنگام تكثير صورت مي‌گيرد، امتيازدهي نوارها و همچنين تشخيص هموزيگوت‌ها از هتروزيگوت‌ها مشكل مي‌باشد.

4) وجود آلل‌هاي خنثي[4] پديده متداول در نشانگرهاي ريزماهواره است كه علت آن هنوز به روشني مشخص نشده است. اما نظريه‌اي در اين ارتباط ارائه شده كه اين پديده را ناشي از جهش در توالي‌هاي احاطه‌كننده جايگاههاي ريزماهواره مي‌داند (27, 28). در واقع آلل‌هاي خنثي به حالتي اطلاق مي‌شود كه براي فرد موردنظر نواري در مكان مورد آزمون مشاهده نگردد. اين پديده خصوصاً در تشخيص افراد هتروزيگوت يا دگر بارور گمراه‌كننده است .(29, 14)

10-7-1- اساس چند شكلي در جايگاههاي ريزماهواره

مطالعات نشان داده‌اند كه شدت جهش در DNA هاي تكراري به مراتب بيشتر از  DNAهاي غيرتكراري است (31). طي برآوردهاي انجام شده مشخص گرديده است كه شدت جهش در ريزماهواره‌ها معادل جانشيني 10000-100 جفت باز مي‌باشد. اين باعث مي شود كه ريزماهواره‌ها براي مطالعات تكاملي در مدت زمان كوتاه (1000-100 سال) مفيد باشند در حاليكه كه جانشيني جفت‌بازها براي مطالعات تكاملي در مدت زمان طولاني (ميليون سال) مفيدند. اين جهش‌ها عموماً در تعداد واحدهاي تكرارشونده اتفاق مي‌افتند. به همين علت تنوع يا چند شكلي در جايگاههاي ريزماهواره فراوان است (32). دو نظریه در مورد چگونگی تغییرات ریز ماهواره ها وجود دارد

1-10-7-1-  مدل کراسینگ اور نا متقارن[5](UCO)

این مدل نا پایداری در ریزماهواره ها را به علت نرخ بالای کراسینگ اورهای نا متقارن در

تکرارهای ریزماهواره می داند.  کراسینگ اورهای نا متقارن نتیجه ای از نوترکیبی بین کرومزومهای شبیه به هم[6] است که به صورت ناقص به صف شده اند.  این مدل پیشنهاد می کند که  کراسینگ اورهای نا متقارن در ریزماهواره ها در نرخ بالایی رخ می دهد. زیرا حضور تکرارها احتمال به صف شدن به طور ناقص را بین کروموزومهای مشابه افزایش  می دهد (54).

2-10-7-1- مدل سر خوردن پلیمراز هنگام همانند سازی(SSM)

فرایند SSM اولین بار برای توضیح موتاسیونهای تغییر چهار چوب در هر نوعی از DNA ارائه شد (51).در این لغزیدن DNA پلیمراز در هنگام همانند سازی موجب جدا شدن رشته الگو و رشته در حال سنتز به طور موقت می شود.  برای ادامه همانند سازی رشته ها باید دو مرتبه کنار هم قرارگیرند.  حال اگر رشته ها به صورت ناقص در کنار هم جفت شوند، موتاسیون رخ می دهد. در مناطق ریزماهواره چون تکرارها به آسانی می توانند به صورت لوپ از  DNA دو رشته ای خارج شوند، این پدیده بیشتر اتفاق می افتد (52).

8-1- واكنش زنجيره اي پليمراز

در واكنشPCR ، DNA در شرايط آزمايشگاهي كپي برداري مي شود و عناصر اساسي فر ايند همانند سازي  DNAدر حاات طبيعي مورد استفاده قرار مي گيرند. در سلول زنده فرايند همانند سازي بسيار پيچيده است و آنزيمـها و پروتئيـن هاي زيادي در كپـي برداري از ژنوم دخـيل  اند، ا ما PCR تنها اجزاء اصلي اين ماشين همانند سازي پيچيده را براي تكثير قطعات كوتاه DNA در لوله آزمايش مورد استفاده قرار مي دهد .

1-8-1- اجزای واکنش PCR

1-1-8-1- آنزیم

آنزيمDNA  Taq [7] پليمراز رايج ترين آنزيم مورد استفاده در PCR است. كه از نوعي مايكو باكتريوم[8] گرما دوست به نام aquaticus thermus  بدست مي آيد، درجه حرارت مناسب براي فعاليت اين آنزيم بسته به DNA الگو ،80-75 درجه سانتي گراد است كه اختصاصي بودن واكنش را افزايش مي دهد (18).

2-1-8-1-مخلوط ذروكسي نوكلئوتيد تري فسفات ( dNTPs )

dNTP با خلوص بالا بصورت 4 محلول پايه منفرد (هر كدام شامل تنها يك نوع dNTP ) و يا بصورت يك مخلوط از چهار نوع dNTP تهيه می شود.  در غلظتهاي پايين dNTP (10 تا 100 ميكرومولار) DNA Taq پليمراز عملكرد بالايي دارد ولي در شرايط عادي نيز انجام PCR باغلظت حدود 100 ميكرومول قابل انجام مي باشد. غلظت مناسب dNTP در واكنش تكثير به عوامل متعددي مانند غلظت MgCl2  ، غلظت آغازگر ها[9] ، تعداد سيكلهاي PCR ، طول محصولات تكثير يافته و رقت واكنش بستگي دارد (33).

3-1-8-1-  DNA الگو

معمولاً DNA  الگو توسط محققين تهيه مي شود. DNA ممكن است دو رشته و يا تك رشته باشد اندازه ملكول DNA فاكتور مهمي در انجام PCR محسوب نمي شود.  ولي هنگامي كه ازDNA ژنومي با وزن ملكولي بسيار بالا استفاده مي شود، بهتر است قبل از تكثير، DNA با آنزيمهاي برشي هضم شود تا واكنش تكثير بهتر صورت بگيرد (34).

4-1-8-1-  آغازگرها

آغازگرها بر روي رشته الگو به تواليهاي مكمل وصل مي شوند و حدود محصولات تكثير را مشخص    مي كنند.  طول آغازگرها از جمله عوامـلي است كه در طـراحي آغازگر مورد توجه قـرار مي گيرد. با افزايش طول آغازگر ميزان اختصاصي بودن فراورده هاي PCR نيز افزايش مي يابد. آغازگرهاي جفت بايد به گونه اي طراحي شوند كه انتهاي OH ' 3 آنها مكمل نباشند،تا احتمال تشكيل دايمرهاي[10]           آغازگر – آغازگر كاهش يابد.  آغاز گرها بايد از تعداد تقريباً برابر از هر 4 باز ساخته شده باشند و در طراحي آنها از نواحي باتواليهاي غير معمول اجتناب شود.   محتواي GC در پايداري هيبريد آغازگر- الگو مؤثر است. يك آغازگر بايد داراي تعداد تقريباً مساوي از هر نو كلئوتيد باشد.  آغازگر ها نبايد ساختار ثانويه تشكيل دهند و دو انتهای آنها نبايد مكمل باشند (33و35).

5-1-8-1- بافرها و كلريد منیزيوم

معمولترين بافر مورد استفاده براي فعاليت آنزيمTaq DNA  پلميراز، داراي تركيبات ,Trise-Hl ,Kcl ,MgCl2 Geletin است.  در صورت استفاده از ساير آنزيمهاي پليمراز مقاوم به حرارت تركيبات بافر متفاوت خواهد بود. غلظت2 MgCl در مخلوط نهايي واكنش مي تواند متغير باشد. معمولاً اين ميزان mM 5-5 /. (متناسب با نوع كار )  است.  يون2+ Mg قادر است با   dNTPها يك كمپلكس محلول تشكيل دهد كه براي عملکرد كردن dNTp ضروري است. اين يون همچنين فعاليت پليمرازي را تحريك مي كند و دماي ذوب DNA و واكنش متقابل پرايمر/ الگو را افزايش مي دهد.

2-8-1- عوامل مؤثر براختصاصي بودن واكنش PCR

مهمترين پارامترهايي كه بر اختصاصي بودن واكنش مؤثرند شامل موارد زير است:

1-2-8-1- غلظت مخلوط  PCR

غلظت مناسب  يون منیزیوم ، آغاز گرها، dNTP و آنزيم Taq DNA پليمراز در اختصاصي بودن واكنش مؤثر است، غلظت MgCl داراي اثرات عميقي بر روي ويژگي محصول PCR است. بطور معمول ، مقدار كم   MgClمنجر   به محصول كم و+2 Mg اضـافي منجربه جمع شدن محـصول غيـر اختصاصـي مي گردد ( ,33 19).  غلظت dNTP و+2 Mg بايد همزمان تغيير كند. از طرفي يونهاي آمونيوم و پتاسيم اثر متضادي بر PCR دارند. تشكيل باندهاي ضعيف همچنين مي تواند ناشي از پايين بودن غلظت آنزيم باشد.

2-2-8-1- دما

الف) دماي واسرشت سازي : اگر اولين مرحله واسرشت سازي بطور مؤثر انجام نشود، ملكولهاي دو رشته به سرعت بهم متصل مي شوند و مانع اتصال مؤثر آغاز گر و بسط  DNAخواهند شد.  براي الگوهاي غني از GC ، افزايش دما در اين مرحله ممكن است ضروري باشد.

ب) دماي اتصال : بازدهي و اختصاصي بودن هر واكنش PCR به اختصاصي بودن هيبريداسيون آغازگر به مكان هدف بستگي دارد.  عموماً دماي بالاتر در اين مرحله اتصال منجر به اختصاصي شدن اتصال آغازگر به الگوي هدف مي شود. دماي پايين تر اتصالات اشتباهي بيشتري بين الگو و  آغاز گر ايجاد مي كند و منجر به افزايش تكثير تواليهاي غير هدف مي شود.

3-2-8-1- تعداد و طول سيكل

عموماً تعداد سيكلها بايد تا حد ممينيم جهت توليد محصول كافي و مناسب نگهداري شود.  مدت زمان انتقال از دماهاي مختلف فاكتور مهم ديگري است عموماً انتقال سريعتر اختصاصي بودن واكنش را افزايش مي دهد (36).

4-2-8-1- افزاينده هاي PCR

تركيبات و افزاينده هاي متعددي بر اختصاص بودن يا بازدهي PCR مؤثر هستند كه دماي اتصال مؤثر واكنش را افزايش مي دهند . اين عوامل اتصال اختصاصي آغازگر به الگو را افزايش مي دهند و در اين صورت عملكرد و طول محصول را بهبود مي بخشند (35 ).

برای دیدن قسمت های دیگر این تحقیق لطفا" از منوی جستجوی سایت که در قسمت بالا قرار دارد استفاده کنید. یا از منوی سایت، فایل های دسته بندی رشته مورد نظر خود را ببینید.

لینک متن کامل با فرمت ورد

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *