پروژه رشته کشاورزی درباره خانواده گلسرخیان – قسمت سوم

-7-1- چگونگی ایجاد میكروستلایت‌ها

مهمترین عامل در تولید ریزماهواره‌ها موتاسیون در تعداد واحدهای تكرار شونده از طریق عدم جفت‌شدن ناشی از لغزش در طول رشته[1] و یا خطاهای همانند سازی DNA، عنوان شده است. گاهی DNA پلی‌مراز در طول همانندسازی در نواحی تكرار شونده سر می‌خورد و باعث تغییر در تعداد واحد تكرار شونده می‌شود. در حقیقت سرخوردن DNA پلیمراز در طول نواحی تكراری باعث عدم جفت‌شدن كامل دو رشته DNA گشته و در نهایت حلقه‌هایی در رشته الگو یا رشته جدید ایجاد می شود. اگر نتیجه همانندسازی ایجاد واحدهای تكرارشونده اضافی باشد، حلقه در رشته جدید به وجود می‌آید ولی اگر نتیجه همانندسازی كاهش در واحدهای تكرار شونده باشد، حلقه در رشته الگو تشكیل خواهد شد (12).

نکته مهم : برای استفاده از متن کامل تحقیق یا مقاله می توانید فایل ارجینال آن را از پایین صفحه   کنید. سایت ما حاوی تعداد بسیار زیادی مقاله و تحقیق دانشگاهی در رشته های مختلف است که می توانید آن ها را به رایگان   کنید

6-7-1- خصوصیات نشانگرهای SSR

نشانگرهای SSR خاص یك مكان ژنی می‌باشند و به صورت هم بارز توارث می‌یابند. این نشانگرها علاوه بر تنوع آللی بالایی كه نشان می‌دهند، در كل ژنوم نیز پراكنده شده‌اند. اگرچه هزینه استفاده از این نوع نشانگرها زیاد است ولی به واسطه پتانسیل بالای آنها در تشخیص پلی مورفیسم و هتروزیگوسیتی در گونه های موجودات زنده به فراوانی استفاده می شوند (17).  هر چند كه ریز ماهواره‌های هر موجودی اختصاصی است ولی توالی‌های احاطه‌كنده توالی‌های تكراری در گونه‌های خویشاوند حفظ شده می‌باشد. از اینرو آغازگرهای طراحی شده برای یك گونه قابل استفاده در گونه‌های خویشاوند هستند (10).  در SSR نیز مانند نشانگرهای AFLP می‌توان از فرایند چند تركیبی بهره برد. بدین ترتیب تكثیر همزمان[2] مكانهای ژنی چند گانه در یك PCR صورت می‌گیرد. چند تركیبی همچنین می‌تواند به صورت تركیب قطعات آللی بیش از یك مكان ژنی در یك چاهك الكتروفورز باشد (18).

7-7-1- كاربردهای نشانگرهای SSR

امروزه ریزماهواره‌ها به علت تعداد زیاد و پراكنش این توالی‌ها در ژنوم، یكی از نشانگرهای مولكولی مفید و سودمند در گونه‌های گیاهی از جمله ذرت، سویا، براسیكاسه، برنج، جو، ارزن، گوجه، سورگوم و انواع درختان میوه مانند سیب می‌باشند (14).  مهمترین كاربرد   ریز ماهواره‌ها شامل مطالعه تنوع ژنتیكی و تكامل (10)، تهیه نقشه‌های ژنتیكی، مطالعات اكولوژیكی و تكامل جمعیت‌ها و گزینش به كمك نشانگر می‌باشد   .(19)

8-7-1- مزایای ریز ماهواره ها

1) فراوانی در ژنوم و سطح بالای تنوع آللی در مكان‌های ریزماهواره

2) توزیع تصادفی در سراسر ژنوم

3) توارث هم بارز

4) از آنجا كه هر نشانگر ریز ماهواره به منزله یك مکان ژنی است، بنابراین هر نوار، یك مكان ژنی به حساب می‌آید.  از این خاصیت در مطالعات تكاملی و ژنتیك جمعیت و تجزیه‌های ژنتیكی استفاده می‌شود.  همچنین برآورد اندازه آلل‌ها در یك مكان به كمك مدلهای رگرسیونی و نیز فراوانی آللی امكان‌پذیر می‌باشد(30,27,20 ,22, 23).

5)تکرار پذیری بالا بدلیل طول نسبتاً زیاد آغازگرهای ریزماهواره (25-15 نوكلئوتیدی) و اختصاصی بودن جایگاه اتصال آنها

6) با توجه به اینكه توالی‌های احاطه كننده واحدهای تكراری در داخل گونه و حتی در گونه‌های داخلی جنس‌ها، حفظ شده‌اند، بنابراین این نشانگرها از اهمیت خاصی در مطالعات اكولوژیكی و فیلوژنتیكی برخوردارندو همچنین آغازگرهای طراحی شده برای یك گونه قابل استفاده در گونه‌های خویشاوند هستند (24, 14,10)

7) در این نشانگرها، مشكل همولوگ بودن نوارهای هم اندازه كه در نشانگرهای RAPD و AFLP اتفاق می‌افتد، وجود ندارد (21).

8) اگرچه هزینه استفاده از این نوع نشانگرها زیاد است ولی به واسطه پتانسیل بالای آنها در تشخیص پلی‌مورفیسم و هتروزیگویستی، به فراوانی استفاده میشود (17).

9) در SSR نیز مانند نشانگرهای AFLP می‌توان از فرآیند چند تركیبی بهره برد. بدین ترتیب که تكثیر همزمان مكانهای ژنی چندگانه در یك PCR صورت می‌گیرد. چند تركیبی همچنین می‌تواند به صورت تركیب قطعات آللی بیش از یك مكان ژنی در یك چاهك الكتروفورز باشد (18).

9-7-1- معایب ریز ماهواره‌ها

1) مشكل عمده ریزماهواره‌ها طراحی اولیه آغازگرهای آنهاست كه بسیار پرهزینه و وقت‌گیر است. شناسایی و طراحی اولیه آغازگرها، نیاز به شناسایی توالی‌های تكراری در كروموزوم‌ها و توالی‌های احاطه‌كننده آنها و در نهایت توالی‌یابی دارد. از اینرو در گیاهانی كه روی آنها كار نشده   است، بسیار هزینه‌بر می‌باشد   .(25,  26)

2) گاهاً ممكن است به علت تكرار بیش از یك بار یك مكان خاص در ژنوم، امكان امتیازدهی همبارز الگوی نواری وجود نداشته باشد.

3) به علت ظهور نوارهای Stutter كه به دلیل سرخوردن[3] آنزیم Tag پلیمراز در هنگام تكثیر صورت می‌گیرد، امتیازدهی نوارها و همچنین تشخیص هموزیگوت‌ها از هتروزیگوت‌ها مشكل می‌باشد.

4) وجود آلل‌های خنثی[4] پدیده متداول در نشانگرهای ریزماهواره است كه علت آن هنوز به روشنی مشخص نشده است. اما نظریه‌ای در این ارتباط ارائه شده كه این پدیده را ناشی از جهش در توالی‌های احاطه‌كننده جایگاههای ریزماهواره می‌داند (27, 28). در واقع آلل‌های خنثی به حالتی اطلاق می‌شود كه برای فرد موردنظر نواری در مكان مورد آزمون مشاهده نگردد. این پدیده خصوصاً در تشخیص افراد هتروزیگوت یا دگر بارور گمراه‌كننده است .(29, 14)

10-7-1- اساس چند شكلی در جایگاههای ریزماهواره

مطالعات نشان داده‌اند كه شدت جهش در DNA های تكراری به مراتب بیشتر از  DNAهای غیرتكراری است (31). طی برآوردهای انجام شده مشخص گردیده است كه شدت جهش در ریزماهواره‌ها معادل جانشینی 10000-100 جفت باز می‌باشد. این باعث می شود كه ریزماهواره‌ها برای مطالعات تكاملی در مدت زمان كوتاه (1000-100 سال) مفید باشند در حالیكه كه جانشینی جفت‌بازها برای مطالعات تكاملی در مدت زمان طولانی (میلیون سال) مفیدند. این جهش‌ها عموماً در تعداد واحدهای تكرارشونده اتفاق می‌افتند. به همین علت تنوع یا چند شكلی در جایگاههای ریزماهواره فراوان است (32). دو نظریه در مورد چگونگی تغییرات ریز ماهواره ها وجود دارد

1-10-7-1-  مدل کراسینگ اور نا متقارن[5](UCO)

این مدل نا پایداری در ریزماهواره ها را به علت نرخ بالای کراسینگ اورهای نا متقارن در

تکرارهای ریزماهواره می داند.  کراسینگ اورهای نا متقارن نتیجه ای از نوترکیبی بین کرومزومهای شبیه به هم[6] است که به صورت ناقص به صف شده اند.  این مدل پیشنهاد می کند که  کراسینگ اورهای نا متقارن در ریزماهواره ها در نرخ بالایی رخ می دهد. زیرا حضور تکرارها احتمال به صف شدن به طور ناقص را بین کروموزومهای مشابه افزایش  می دهد (54).

2-10-7-1- مدل سر خوردن پلیمراز هنگام همانند سازی(SSM)

فرایند SSM اولین بار برای توضیح موتاسیونهای تغییر چهار چوب در هر نوعی از DNA ارائه شد (51).در این لغزیدن DNA پلیمراز در هنگام همانند سازی موجب جدا شدن رشته الگو و رشته در حال سنتز به طور موقت می شود.  برای ادامه همانند سازی رشته ها باید دو مرتبه کنار هم قرارگیرند.  حال اگر رشته ها به صورت ناقص در کنار هم جفت شوند، موتاسیون رخ می دهد. در مناطق ریزماهواره چون تکرارها به آسانی می توانند به صورت لوپ از  DNA دو رشته ای خارج شوند، این پدیده بیشتر اتفاق می افتد (52).

8-1- واكنش زنجیره ای پلیمراز

در واكنشPCR ، DNA در شرایط آزمایشگاهی كپی برداری می شود و عناصر اساسی فر ایند همانند سازی  DNAدر حاات طبیعی مورد استفاده قرار می گیرند. در سلول زنده فرایند همانند سازی بسیار پیچیده است و آنزیمـها و پروتئیـن های زیادی در كپـی برداری از ژنوم دخـیل  اند، ا ما PCR تنها اجزاء اصلی این ماشین همانند سازی پیچیده را برای تكثیر قطعات كوتاه DNA در لوله آزمایش مورد استفاده قرار می دهد .

1-8-1- اجزای واکنش PCR

1-1-8-1- آنزیم

آنزیمDNA  Taq [7] پلیمراز رایج ترین آنزیم مورد استفاده در PCR است. كه از نوعی مایكو باكتریوم[8] گرما دوست به نام aquaticus thermus  بدست می آید، درجه حرارت مناسب برای فعالیت این آنزیم بسته به DNA الگو ،80-75 درجه سانتی گراد است كه اختصاصی بودن واكنش را افزایش می دهد (18).

2-1-8-1-مخلوط ذروكسی نوكلئوتید تری فسفات ( dNTPs )

dNTP با خلوص بالا بصورت 4 محلول پایه منفرد (هر كدام شامل تنها یك نوع dNTP ) و یا بصورت یك مخلوط از چهار نوع dNTP تهیه می شود.  در غلظتهای پایین dNTP (10 تا 100 میكرومولار) DNA Taq پلیمراز عملكرد بالایی دارد ولی در شرایط عادی نیز انجام PCR باغلظت حدود 100 میكرومول قابل انجام می باشد. غلظت مناسب dNTP در واكنش تكثیر به عوامل متعددی مانند غلظت MgCl2  ، غلظت آغازگر ها[9] ، تعداد سیكلهای PCR ، طول محصولات تكثیر یافته و رقت واكنش بستگی دارد (33).

3-1-8-1-  DNA الگو

معمولاً DNA  الگو توسط محققین تهیه می شود. DNA ممكن است دو رشته و یا تك رشته باشد اندازه ملكول DNA فاكتور مهمی در انجام PCR محسوب نمی شود.  ولی هنگامی كه ازDNA ژنومی با وزن ملكولی بسیار بالا استفاده می شود، بهتر است قبل از تكثیر، DNA با آنزیمهای برشی هضم شود تا واكنش تكثیر بهتر صورت بگیرد (34).

4-1-8-1-  آغازگرها

آغازگرها بر روی رشته الگو به توالیهای مكمل وصل می شوند و حدود محصولات تكثیر را مشخص    می كنند.  طول آغازگرها از جمله عوامـلی است كه در طـراحی آغازگر مورد توجه قـرار می گیرد. با افزایش طول آغازگر میزان اختصاصی بودن فراورده های PCR نیز افزایش می یابد. آغازگرهای جفت باید به گونه ای طراحی شوند كه انتهای OH ‘ 3 آنها مكمل نباشند،تا احتمال تشكیل دایمرهای[10]           آغازگر – آغازگر كاهش یابد.  آغاز گرها باید از تعداد تقریباً برابر از هر 4 باز ساخته شده باشند و در طراحی آنها از نواحی باتوالیهای غیر معمول اجتناب شود.   محتوای GC در پایداری هیبرید آغازگر- الگو مؤثر است. یك آغازگر باید دارای تعداد تقریباً مساوی از هر نو كلئوتید باشد.  آغازگر ها نباید ساختار ثانویه تشكیل دهند و دو انتهای آنها نباید مكمل باشند (33و35).

5-1-8-1- بافرها و كلرید منیزیوم

معمولترین بافر مورد استفاده برای فعالیت آنزیمTaq DNA  پلمیراز، دارای تركیبات ,Trise-Hl ,Kcl ,MgCl2 Geletin است.  در صورت استفاده از سایر آنزیمهای پلیمراز مقاوم به حرارت تركیبات بافر متفاوت خواهد بود. غلظت2 MgCl در مخلوط نهایی واكنش می تواند متغیر باشد. معمولاً این میزان mM 5-5 /. (متناسب با نوع كار )  است.  یون2+ Mg قادر است با   dNTPها یك كمپلكس محلول تشكیل دهد كه برای عملکرد كردن dNTp ضروری است. این یون همچنین فعالیت پلیمرازی را تحریك می كند و دمای ذوب DNA و واكنش متقابل پرایمر/ الگو را افزایش می دهد.

2-8-1- عوامل مؤثر براختصاصی بودن واكنش PCR

مهمترین پارامترهایی كه بر اختصاصی بودن واكنش مؤثرند شامل موارد زیر است:

1-2-8-1- غلظت مخلوط  PCR

غلظت مناسب  یون منیزیوم ، آغاز گرها، dNTP و آنزیم Taq DNA پلیمراز در اختصاصی بودن واكنش مؤثر است، غلظت MgCl دارای اثرات عمیقی بر روی ویژگی محصول PCR است. بطور معمول ، مقدار كم   MgClمنجر   به محصول كم و+2 Mg اضـافی منجربه جمع شدن محـصول غیـر اختصاصـی می گردد ( ,33 19).  غلظت dNTP و+2 Mg باید همزمان تغییر كند. از طرفی یونهای آمونیوم و پتاسیم اثر متضادی بر PCR دارند. تشكیل باندهای ضعیف همچنین می تواند ناشی از پایین بودن غلظت آنزیم باشد.

2-2-8-1- دما

الف) دمای واسرشت سازی : اگر اولین مرحله واسرشت سازی بطور مؤثر انجام نشود، ملكولهای دو رشته به سرعت بهم متصل می شوند و مانع اتصال مؤثر آغاز گر و بسط  DNAخواهند شد.  برای الگوهای غنی از GC ، افزایش دما در این مرحله ممكن است ضروری باشد.

ب) دمای اتصال : بازدهی و اختصاصی بودن هر واكنش PCR به اختصاصی بودن هیبریداسیون آغازگر به مكان هدف بستگی دارد.  عموماً دمای بالاتر در این مرحله اتصال منجر به اختصاصی شدن اتصال آغازگر به الگوی هدف می شود. دمای پایین تر اتصالات اشتباهی بیشتری بین الگو و  آغاز گر ایجاد می كند و منجر به افزایش تكثیر توالیهای غیر هدف می شود.

3-2-8-1- تعداد و طول سیكل

عموماً تعداد سیكلها باید تا حد ممینیم جهت تولید محصول كافی و مناسب نگهداری شود.  مدت زمان انتقال از دماهای مختلف فاكتور مهم دیگری است عموماً انتقال سریعتر اختصاصی بودن واكنش را افزایش می دهد (36).

4-2-8-1- افزاینده های PCR

تركیبات و افزاینده های متعددی بر اختصاص بودن یا بازدهی PCR مؤثر هستند كه دمای اتصال مؤثر واكنش را افزایش می دهند . این عوامل اتصال اختصاصی آغازگر به الگو را افزایش می دهند و در این صورت عملكرد و طول محصول را بهبود می بخشند (35 ).

برای دیدن قسمت های دیگر این تحقیق لطفا” از منوی جستجوی سایت که در قسمت بالا قرار دارد استفاده کنید. یا از منوی سایت، فایل های دسته بندی رشته مورد نظر خود را ببینید.

لینک متن کامل با فرمت ورد

Leave a comment