پروژه رشته کشاورزی درباره خانواده گلسرخیان – قسمت دوم

3-7-1- انواع نشانگرهای ژنتیكی

1-3-7-1- نشانگرهای ریخت‌شناسی (مورفولوژیكی)

تفاوت موجود بین ردیف DNA كروموزوم‌های هر موجود زنده كه ازوالدین به نتاج آنها منتقل می‌شود

می تواند به عنوان یک نشانگر ژنتیكی به كار برده شود. این تفاوت می‌تواند به طرق مختلفی تظاهر یابد. برخی از این تفاوتها به صورت عرضی بوده و در صفات قابل رؤیت در آزمایشات مندلی تجلی می‌نمایند. این گونه نشانه‌ها را نشانگرهای مورفولوژیك می‌نامند .(4) صفات مورفولوژیكی كه عمدتاً توسط یك ژن كنترل می‌شوند می‌توانند به عنوان نشانگرهای ژنتیك مورد استفاده قرار گیرند. این نشانگرها شامل دامنه وسیعی از ژنهای كنترل‌كننده صفات فنوتیپی هستند و جز نخستین نشانگرها به شمار می‌آیند و از زمانهای بسیار دور یعنی از زمانی كه محل ژنها بر روی كروموزوم مشخص شد مورد استفاده قرار می‌گرفتند (12).  گاهی برای مشاهده این نشانگرها باید منتظر ظهورشان ماند.  اگرچه نشانگرهای ریخت‌شناسی در علوم زیستی مورد استفاده قرار گرفته‌اند ولی دارای محدودیت‌هایی اساسی هستند كه موجب توجه محققین به انواع دیگری از نشانگرها فراهم شده است (13).

نکته مهم : برای استفاده از متن کامل تحقیق یا مقاله می توانید فایل ارجینال آن را از پایین صفحه   کنید. سایت ما حاوی تعداد بسیار زیادی مقاله و تحقیق دانشگاهی در رشته های مختلف است که می توانید آن ها را به رایگان   کنید

2-3-7-1- نشانگرهای سیتوژنتیكی

در بسیاری از موجودات زنده تفاوتهایی در گستره كروموزومی مشاهده می‌شود كه می‌توانند به عنوان

نشانگر به كار روند. تلوسنتریك‌ها[1]، جابجایی و الگوهای نواربندی از جمله این نشانگرها می‌باشند (13).

3-3-7-1- نشانگرهای ملکولی در سطح پروتئین

برخی از تفاوت‌های موجود در ردیف DNA بین دو موجود ممكن است به صورت پروتئین‌هایی با اندازه‌های مختلف تجلی نمایند كه از طرق مختلف بیوشیمیایی قابل ثبت و قابل مطالعه خواهد بود. این قبیل نشانگرها را نشانگرهای ملكولی در سطح پروتئین می‌نامند كه از آن جمله می‌توان به سیستم آیزوزایم / آلوزایم[2] اشاره کرد (4).  معمول‌ترین نوع نشانگرهای پروتئین آیزوزایم‌ها هستند كه فرم‌های مختلف یك آنزیم را نشان می‌دهند. نشانگرهای پروتئینی تغییرات را در سطح ردیف و عمل ژن به صورت نشانگرهای همبارز نشان می‌دهند (12).  نشانگرهای پروتئینی دارای معایبی هستند، از جمله اینكه روش‌های رنگ‌آمیزی پروتئین‌ها در مورد آیزوزایم‌ها چندان زیاد نیست همچنین تعداد آیزوزام‌های قابل ثبت و مشاهده كه می‌توان از آنها  به عنوان نشانگر استفاده نمود به صد نمی‌رسد. این محدودیت در تعداد نشانگرهای آیزوزایم از عمده‌ترین معایب آنهاست و موجب كاهش كارایی آنها می‌گردد. از نكات منفی دیگر این نشانگرها محدودیت تنوع ژنتیكی قابل ثبت در آیزوزایم‌هاست.  به عبارت دیگر آیزوزایم‌ها نه  تنها كم هستند بلكه چند شكلی و تفاوت قابل ثبت در آنها چندان زیاد نیست (4). ولی نشانگرهای پروتئینی مزایایی نیز دارند از جمله اینكه: آیزوزایم‌ها مبنای ژنتیكی ساده ای دارند، در بین مكانهای مختلف آیزوزایمی غالباً اثر متقابل ژنی و پلیوتروپی وجود ندارد، با نشانگرهای دیگری كه می‌توانند به طور همزمان در یك جمعیت در حال تفرق بکار روند اثر متقابل ندارند، با ژنهای موردنظر نزدیک بوده و دارای توارث‌پذیری كامل هستند و اندازه گیری آنها آسان است(5).

پیشرفت‌های اخیر در زمینه ژنتیك مولكولی نشانگرهای جدیدی را معرفی كرده‌اند كه سطوح بالایی از چند شكل را بروز می‌دهند و به خوبی برای آنالیز تنوع ژنتیكی در داخل و بین جوامع مناسب هستند.

4-3-7-1- نشانگرهای مولكولی در سطح  DNA

توسعه نشانگرهای مولكولی DNA عصر جدیدی در علم ژنتیك گشوده است و به طوری كه به كمك این نشانگرها ایجاد نقشه‌های فیزیكی و ژنتیكی و شناسایی ژنهای كنترل كننده صفات كیفی و كمی امكان‌پذیر شده است. در سالهای گذشته، از نشانگرهای DNA برای مطالعات پایه‌ای و كاربردی در انسان، حیوان و گیاه استفاده شده است (12).  اكثر نشانگرهای DNA با یك فنوتیپ قابل مشاهده همراه نیستند و این بدین معنی است كه بایدبسیاری از تفاوتهای موجود در سطح DNA را از طریق آنالیز مستقیم DNA مطالعه نمود (6).

5-3-7-1- انواع نشانگرهای DNA

الف) نشانگرهای DNA غیر مبتنی بر PCR[3]

دسته ای از نشانگرهای DNA بدون استفاده از روش واكنش زنجیره‌ای پلیمراز تولید می‌شوند.  سر گروه این دسته از نشانگرها همان تفاوت طول قطعه‌های حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‌های محدودگر است كهRFLP نامیده می‌شود.  از دیگر نشانگرهای غیر مبتنی بر PCR می‌توان از  RLGS, Minisatellites, VNTR نام برد.

– تفاوت طول قطعات حاصل از هضم (RFLP[4])

این تكنیك شامل كلون كردن ردیف‌های منحصر به فرد یا ردیف‌هایی كه دارای نسخ كمی در ژنوم هستند، می‌باشد.  سپس DNA ژنومی توسط آنزیم های برشی خاصی هضم و قطعات حاصله در حامل‌هایی (پلاسمید) كه توسط همان آنزیم برشگر برش داده شده است، جایگذاری می‌شوند. این پلاسمیدها جهت تكثیر و نگهداری به باكتریهای آزمایشگاهی كه اغلب از نوع اشرشیا كلی هستند منتقل می گردند. كلون‌های یاد شده توسط رادیوایزوتوپ‌ها یا با استفاده از روشهای بیوشیمیایی پیچیده‌تر نشان‌دار شده و به عنوان كاوشگر[5] جهت شناسایی قطعات متناظر در DNA ژنومی نمونه‌های كه با آنزیم‌های برشگر هضم شده و بر روی ژل آگارز از هم جدا شده و به غشاهای نایلونی یا نیترو سلولزی منتقل شده‌اند، مورد استفاه قرار می‌گیرند. سیستم آللی یا جهش‌های ژنتیكی از تفاوت طول قطعات حاصل از هضم كه كاوشگرهای مذكور به آنها متصل می‌شوند شناخته می‌شوند (15).

– تعداد متفاوت ردیف‌های تكراری و ماهوارك‌ها

 (VNTR[6]   & Minisatellites)

این دو نوع نشانگر براساس تفاوت در تعداد ردیف‌های با تكرار متوسط در DNA ژنومی موجودات مورد مقایسه ابداع شده‌اند و از نظر تكنیكی مبتنی بر استفاده از كاوشگرهای مصنوعی و كاربرد مواد رادیواكتیو و روش سادرن می‌باشند (15).

–  پویش ژنومی نشانه‌های هضم (RLGS[7])

در سال 1991  Hatadaو  همكاران روشی را برای شناسایی و انگشت‌نگاری موجودات عالی ابداع و معرفی كردند كه پویش ژنومی نشانه‌های هضم نامیده شد. این روش جدید كه برای تجزیه و تحلیل DNA ژنومی به كاربرده می شود بر مبنای این فرضیه است كه نقاط برش اختصاصی آنزیم‌های برشگر می‌توانند به عنوان تشابه و وجه تمایز ارقام و افراد به كار گرفته شوند. در این روش انتهای آزاد مولكولهای DNA كه در اثر صدمات مكانیكی در طی استخراج به وجود آمده‌اند مسدود می‌گردد. سپس DNA توسط آنزیم برشگر هضم شده و نقاط برش به طور مستقیم با فسفر رادیواكتیو نشاندار می‌شوند. سپس با الكتروفورز دو بعدی، قطعات هضم شده DNA از هم جدا شده و خود پرتونگاری صورت می‌گیرد. این روش یك الگوی دو بعدی با هزاران نقطه پراكنده (قطعات نشاندار DNA) به دست می‌دهد كه هر یك می‌توانند به عنوان یك نشانگر به كار گرفته شوند (15).

ب) نشانگرهای DNA مبتنی بر PCR

واكنش زنجیره‌ای پلیمراز كه به طور اختصار PCR خوانده می‌شود روشی بسیار قوی است كه تكثیر ردیف منتخبی از مولكول یك ژنوم را چندین میلیون برابر در كمتر از نیم روز امكان پذیر می‌كند. اما این فرایند هنگامی امكان‌پذیر است كه دست كم ردیف كوتاهی از دو انتهای قطعه DNA مورد نظر معلوم باشد. نشانگرهای  DNAمبتنی بر PCR شامل نشانگرهای آغاز شده تصادفی نظیر [8]RAPD و[9]AFLP و نشانگرهای نشانمند از توالی [10]SCAR، [11]SSR و[12]ALP می باشند(13و14).

RAPD

 در این تکنیک آغازگرهای الیگو نوکلئوتیدی انفرادی کوتاه به طور تصادفی انتخاب می شوند تا مجموعه ای از قطعات DNA را به طور تصادفی در سراسر ژنوم تکثیر نمایند. این تکنیک با استفاده ازDNAی ژنومی گونه های مورد نظر و یک الیگو نوکلئوتید کوتاه  منفرد(معمولا 15 بازی )  انجام  می شود. محصول تکثیر DNA از منطقه ای ایجاد می شود که توسط بخشی از مکانهای آغازگر 15 جفت بازی در جهت مناسب ادامه داده شده است.  DNAی ژنومی دو فرد متفاوت غالبا الگوی تکثیر یافته مختلفی تولید می نماید(20).  کاربردهای این روش عبارتند از: تهیه نقشه های ژنتیکی، مکان یابی ژنهای کنترل کننده صفات، تجزیه ساختار ژنتیکی جمعیتها، انگشت نگاری افراد، نشانگرهای هدفمند برای مناطق خاص ژنوم، شناسایی هیبریدهای سوماتیکی (45).

AFLP

روشی بسیار حساس برای آشکار کردن چند شکلی در سراسر ژنوم است که به طور فزاینده ای در حال عمومیت یافتن است.  این روش که ترکیبی از RFLP و RAPD است، مبتنی بر تکثیر قطعات برش یافته ژنومی با آنزیمهای برشگر [13] خاص و استفاده از ارتباطای چند نوکلئوتیدی کوتاه می باشد (46).  در این روش ژنوم توسط آنزیمهای برشگر برش داده شده، سپس با استفاده از آداپتورهایی که دارای توالی مشخص و توالی نقاط برش می باشند، دو انتهای قطعات برش مسدود می شود و بعد از آن توسط آغازگرهایی با توالیهای مشخص بر اساس توالی آداپتور تکثیر صورت می گیرد.  قطعات حاصله بر روی ژل برده شده و باندهای حاصله که هر کدام یک نشانگر ژنتیکی است، مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرند (46 و 47 ).

این تکنیک در باکتری شناسی و قارچ شناسی برای تشخیص در سطح گونه (48) و نیز در گیاهان، حیوانات و انسان برای تعیین تنوع ژنتیکی و شناسایی گونه و نژاد کاربرد زیادی دارد (49 ).

 SCAR

در این روش یک قطعه از DNAی ژنومی مربوط به جایگاه ژنی معین توسط یک جفت آغازگر الیگو نوکلئوتیدی خاص از طریق تکثیر PCR قابل شناسایی می گردد.  Williams در سال 1991 نشانگرهای RFLP را از راه ردیف یابی به نشانگرهای SCAR تبدیل کرد و سپس از این آغازگرها برای تکثیر DNAی ژنومی استفاده نمود.  همچنین Paran و Michelmore (1993) نشانگرهای RAPD را نیز به نشانگرهای SCAR تبدیل کردند، به طوریکه قطعه های تکثیر شده RAPD را همسانه و سپس ردیف یابی کردند.  بر اساس انتهای هر RAPD همسانه شده، آغازگرهای  SCAR طراحی شدند.  شرایط تکثیر SCAR مانند RAPD است.  در نشانگر SCAR تنها یک جایگاه ژنی شناسایی می شود و تکرار پذیری آن نسبت به نشانگر های RAPD بیشتر است و نحوه توارث به صورت همبارز می باشد.  اما نسبت به  RAPD هزینه و زمان یشتری نیاز دارد(50).

4-7-1- ردیف‌های تكراری

در یوكاریوتها، ردیف‌های رمز شونده فقط بخش محدودی از DNA را در برمی‌گیرند. در حقیقت بخش عمده DNA را ردیف‌های غیررمزشونده تشكیل می‌دهند كه عمل و نقش آنها دقیقاً مشخص نشده است. قسمت عمده ردیف‌های غیررمزشونده را DNA با ردیف‌های پشت سرهم تكرار شونده[14] تشكیل می‌دهد. ردیف‌های تكرار شونده براساس اندازه واحد تكرار به ماهواره‌ها[15]، ماهوارك‌ها[16] و ریزماهواره‌ها تقسیم می‌شوند. هر یك از این DNAهای تكرار شونده مقدار زیادی چند شكلی نشان می‌دهند (12).  نكته قابل توجه این است كه قطعات DNA احاطه كننده واحدهای تكراری، حفاظت شده ‌هستند. بدین مفهوم كه افراد از نظر این قطعات نه تنها در داخل گونه بلكه در بین گونه‌ها هم تفاوت ندارند. به عبارت دیگر شدت جهش در این قطعات، بسیار كم و حتی نادر است. بنابراین این توالی‌ها بسیار مناسب جهت طراحی آغازگرهایی برای تكثیر قطعات تكراری در ژنوم می‌باشند (14, 16).

1-4-7-1- ماهواره‌ها

در ماهواره‌ها، واحدهای تكرار شونده از چند جفت باز تا چند صد جفت باز تكرار می‌شوند. در پستانداران ممكن است ماهواره‌ها كمتر از 10 درصد (انسان) تا بیش از 50 درصد (كانگارو) از ژنوم را در تشکیل دهند.  ماهواره‌ها بیشتر در منطقه هتروكروماتین نزدیك سانترومرها و تلومرها (جایگاههایی كه نوتركیبی میوزی بسیار كم است) یافت می‌شوند. ماهواره‌ها معمولاً رونوشت‌برداری نمی‌شوند و تاكنون هیچ عمل مشخصی برای آنها شناخته نشده است، اگرچه براساس اینكه عمدتاً در نواحی هتروكروماتین دیده می‌شوند، چنین تصور می‌شود كه در جفت‌شدن، تفرق یا نوتركیبی كروموزومها نقش دارند. از ماهواره‌ها برای نقشه‌یابی ژنوم انسان به عنوان نشانگرهایی كه با سانترومر ارتباط دارند، استفاده می‌شود (12).

 2-4-7-1- ماهوارك‌ها

ماهوارك‌ها واحدهای 10 تا 60 جفت بازی هستند كه ممكن است صدها بار تكرار شده باشند. آنها معمولاً یك هسته مشترك 10 تا 15 جفت بازی دارند كه احتمالاً در تنوع‌پذیری ماهوارك‌ها موثرند. ماهوارك‌ها بیشتر در نواحی یوكروماتین ژنوم پستانداران، قارچها و گیاهان متمركزند. تنوع‌پذیری ماهوارك‌ها در حدی است كه گاهی در انگشت‌نگاری DNA انسان مورد استفاده قرار می‌گیرند (9).

3-4-7-1- ریز ماهواره‌ها (میكروستلایت‌ها یا SSRs[17]):

ریزماهواره‌ها در دهه 1970 شناخته شدند و برای اولین بار در ژنتیك انسانی جهت تشخیص برخی بیماریها كه با تغییر در واحدهای تكراری همراه بود استفاده شدند (14). به عنوان مثال یك زیرمجموعه از میكروستلاتیها كه شامل تكرارهای تری نوكلئوتیدی می‌باشند نقش بسیار مهمی را در آشفتگی‌های عصبی بازی می‌كنند. در بیماریهایی مانند: Fragilex syndrome، Myotonic dystrophy، Spinal-bulbar muscular atrophy و در بعضی از سرطانهای انسانی نقش دارند (8).  اصطلاح ریز ماهواره اولین بار توسط لیت ولوئی به كار برده شد. پس از آن با اسامی دیگر از جمله توالی‌های تكراری كوتاه (STR[18])، چند شكلی توالی‌های ساده (SSLP[19]) و ریزماهواره یا توالی‌های تكراری ساده(SSR) ن

 نیز خوانده شدند (17، 14).  ریزماهواره‌ها شامل واحدهای تكی، دوتایی، سه تایی، چهار تایی، پنج تایی و یا شش تایی تكرار شونده‌اند كه در ژنوم بیشتر یوكاریوتها پراكنده‌اند (12).  به عبارت دیگر نواحی تكراری پشت سر هم می‌باشند كه طول واحد تكرار آنها بین 1-6 جفت باز است.  در همه جا موجودند چه در سلول یوكاریوتی و چه در سلول پروكاریوتی. آنها حتی در ژنوم كوچكترین باكتریها هم وجود دارند (8). در ژنوم میتوكندری مخمر نیز وجود تعداد زیادی ریزماهواره به اثبات رسیده است و مشخص شده است كه ژنوم میتوكندری قطعات با توالی پلی GT دارای پایداری كمتری نسبت به توالی‌های پلی  AT هستند و عموماً تغییرات از نوع حذف در آنها بیشتر از اضافه‌شدن می‌باشد. اما در ژنوم هسته توالی‌های پلی GT و AT پایداری مشابهی دارند و تغییرات در آنها بیشتر از نوع اضافه‌شدن است. همچنین تحقیقات نشان داده كه پلی GT  در میتوكندری سلولهای دیپلوئید بسیار پایدارتر از هاپلوئید است (15). البته باید توجه كرد كه تعداد نوكلئوتیدها در هر واحد تكراری برای اكثر تكرارهای یك مكان ژنی ریز ماهواره یكسان است وآنچه سبب تنوع می‌شود، تفاوت در تعداد واحدهای تكرار است (14). تفاوت عمده ریزماهواره‌ها با ماهواركها در این است كه ریزماهواره‌ها در طول ژنوم پراكنده می‌باشند و معمولاً قابلیت رونوشت برداری به RNA را دارند (10).  همچنین ریزماهواره‌ها برخلاف ماهواره‌ها و ماهوارك‌ها دارای توزیع تصادفی در ژنوم هستند به طوری كه در هر 10 كیلو باز از توالی DNA حداقل یك توالی ریزماهواره‌ای دیده می‌شود (13, 4). ریز ماهواره‌ها به سه گروه عمده تكرارهای كامل، تكرارهای ناكامل (معمولاًٌ توسط بازهای غیرتكرارشونده قطع می‌شوند) و تكرارهای مركب (دو یا تعداد بیشتری از واحدهای تكرار در مجاور یكدیگر) تقسیم می‌شوند (11).

برای دیدن قسمت های دیگر این تحقیق لطفا” از منوی جستجوی سایت که در قسمت بالا قرار دارد استفاده کنید. یا از منوی سایت، فایل های دسته بندی رشته مورد نظر خود را ببینید.

لینک متن کامل با فرمت ورد

Leave a comment