سایت دانلود

تحقیق ها مقاله ها و پایان نامه ها
محیط زیست

گزارشات آزمايشات ميكروبيولوژي محيطي – قسمت اول

 

عنوان آزمايش : 1- جمع آوري و نگهداري نمونه هاي خاك

2 - تهيه لام هاي دفن شده در خاك

آشنايي با روش نمونه برداري، نگهداري و تهيه لام از خاك

ميكرو بيولوژي و شيمي خاك حايز اهميت مي باشند كه بر اساس اصول صحيح جمع آوري و نگهداري كرده و آزمايش مورد نظر را انجام مي دهيم نكته مهم اينكه خاك از جمله محيطهايي است كه حتي در يك محدوده معين ويژگيها و شرايط آن از نظر فيزيكي- بيولوژيك و شيميايي با همديگر فرق دارند. مثلاً در يك محدوده خاص مثل بلندي تپه در مقايسه با ارتفاع كم ويژگيهاي متفاوت مي باشد و حتي در يك باغچه كه به آن كود داده مي شود جاهايي كه كود بيشتري دريافت كرده و يا كمتري دريافت كرده شرايط متفاوتي دارد، بنابراين تهيه اين نمونه ها يا به منظور انجام آزمايشهايي ميكرولوژي انجام مي شود و يا آزمايشهاي شيميايي كه اين دو تفاوتي كوچك از نظر جمع اوري و نگهداري دارند. براي نمونه برداري و جمع آوري از دستگاههاي نمونه بردار خاصي آگلر استفاده مي شود كه غالباً نوعي لوله نمونه برداري است كه طول و قطر مشخص دارد و جنس آن عموماً فلزي مي باشد و ويژگي كه دارند روي سطح آنها مدرج شده است كه به منظور اندازه گيري از عمق مورد استفاده قرار مي گيرد كه به شكل عمودي بر روي نقطه اي كه براي برداشت نمونه مشخص شده است قرار گرفته است و با فشار دادن دست يا فشارمكانيكي در خالك فرورفته تا عمق مورد نظر ازخاك پر مي شوند و بعد محتويات آنها با يك ظرف ترجيحاً استريل يا يك كيسه پلاستيكي منتقل مي شوند.

نکته مهم : برای استفاده از متن کامل تحقیق یا مقاله می توانید فایل ارجینال آن را از پایین صفحه   کنید. سایت ما حاوی تعداد بسیار زیادی مقاله و تحقیق دانشگاهی در رشته های مختلف است که می توانید آن ها را به رایگان   کنید

مرحله دوم نگهداري نمونه ها مي باشد كه اگر مجبور به نگهداري شويم بايستي نمونه هاي جمع آوري شده در شرايطي كه از نظر دما و رطوبت تشابه زيادي با زمان برداشت نمونه دارند نگهداري شوند كه مثلاً در مورد نمونه هاي ميكروبي دماي مشابه دماي برداشت نمونه مناسب بوده كه فعاليت ميكرو ارگانسيم ها را كند مي كند در مورد آزمايشهاي شيميايي روشهايي مانند منجمد كردن و خشك كردن براي نگهداري مورد نظر مي باشد .

مرحله انجام آزمايش:

براي شروع كار ابتدا يك نقطه مناسب را براي برداشت نمونه در نظر مي گيريم و در مرحله اول بايد يك برچسب تهيه كرده و مشخصات دقيق محل برداشت نمونه را روي آن برچسب مي نويسيم يعني اينكه اگر براي برداشت مجدد نياز باشد بايستي بتوانيم نمونه برداري را عيناً تكرار كنيم كه بتدريج فناوريهاي جديد مثل   GPS نيز مورد استفاده قرار مي گيرد در درجه دوم مشخصات ظاهري خاك را بايستي يادداشت كنيم كه شامل: نوع دانه بندي خاك- پستي و يا بلندي - خشكي و ديگر مشخصات و بعد از مدتي كه مراجعه كرديم متوجه تغييرات آن شويم معمولاً اين برچسبها حاوي تاريخ، شرايط اقليمي، نام نمونه بردار و هر اطلاعات ديگري كه لازم بوده و به تفسير نتايج آزمايش كمك كند مي باشد.

انجام آزمايش:

پس از تحويل گرفتن وسايل مورد نياز شامل يك كيسه نايلون تميز و دماسنج و تيغه محل نمونه برداري پشت آزمايشگاه كنار درخت بزرگ زبان گنجشك و قسمت شمال غربي آن تعيين گرديد و ضمن مراجعه در محل با استفاده از لوله مخصوص كه براي نمونه برداري پيش بيني شده بود با فشار مكانيكي در محل مورد نظر اقدام به نمونه برداري و تخليه آن داخلا يك پلاستيكي گرديد البته قبلاً با استفاده از دما سنج مخصوص و با فرو كردن آن در داخل و ايست چند دقيقه اي درجه حرارت خاك تعيين گرديد سپس درجه حرارت هوا نيز اندازه گيري و بود. پس از ثبت مشخصات شامل 1- نام نمونه بردار: علي اكبر نوروزي 2- ساعت 15/15 روز دوشنبه 3/12/84 3- مكان: آموزشكده محيط زيست پشت آزمايشگاه ميكرولوژي جنب درخت بزرگ زبان گنجشك و قسمت شمالي آن 4- درجه حرارت هوا 5- درجه حرارت خاك 6- شرايط اقليمي : هوا مرطوب و پس از حدود ده ساعت بارندگي متناوب

در مرحله بعد از تحويل گرفتن يك عدد بوكال ( وسيله قراردادن خاك و لام ها و تماس آنها با همديگر به منظور ايجاد تماس مناسب محيط كشت با خاك) و 6 عدد لام يا اسلايد كه با استفاده از ميكروفيلم آنها را به هم چسباند هو نفوذ ناپذيري آن را تضمين مي كنيم كه يك طرف آنها را با سواپ كه قبلاً با استفاده از محيط كشت نوترينت براث (NB) آغشته مي كنيم ( در شرايط استريل)

پس از آماده كردن سه عدد اسلايد دو طرفه كه يك طرف آن آغشته به محيط كشت NB  مي باشد آنها را با فاصله در داخل بوكال قرار مي دهيم و سپس با استفاده از قاشقك ميان آنها را با آرامي با خاك پر مي نماييم و درب بوكال را بسته و در دماي گرما گذاري مي كنيم كه اگر شرايط دماي اطاق اين باشد مطلوب است در غير اينصورت آن را داخل انكوباتور به مدت دو هفته قرار مي دهيم تا ميكروارگانيم ها روي آن رشد كند.

عنوان آزمايش: الف) شمارش باكتريهاي هتروتروف هوازي خاك به روش plate

count

هدف: آشنايي با روش كلاسيك شمارش باكتريهاي زنده

تاريخ: 10/12/84

انجام آزمايش:

باكتريها غالبترين جمعيت ميكروارگانيم هاي خاك را تشكيل مي دهند و در خاكهاي معمولي بين عدد در هر گرم خاك موجود مي باشند در خاكهاي فاضلاب و لجن فعال يا كشاورزي يا كود دهي بالا با ميكروبي بالايي دارند.

استفاده از رفتهاي متوالي و كشت در پليت به روش pour plate مي باشد خاك بدليل اينكه داراي باكتريهاي زيادي مي باشد قابل كشت بصورت مستقيم نمي باشد لذا ابتدا سوسپانيون را تهيه و با استفاده از مايع مناسب كه آسيبي به سلولها نرساند ماده جامد را وارد آن مي كنيم و با استفاده از روشهاي مكانيكي آن را به هم مي زنيم يا با استفاده از دستگاهي بنام shaker كه با دور مشخص ( مثلاً 2000RPM يادويست دور در دقيقه ) به مدت ده دقيقه كه سلولها به هم چسبيده جدا و معلق شوند البته اين روش علاوه بر خاك در مواد غذايي نيز مورد استفاده دارد . روش مناسب دقيق سازي تهيه وقتهاي متوالي است كه مايع مناسب براي آن سرم فيزيولوژيك يا آب مقطر مي باشد.

دقت                       (خاك) سرم فيزيولوژيك

كه به ازاي هر رقت يك پليت خالي استريل در نظر مي گيريم البته صحيح آن 3 دست براي هر لوله مي باشد كه به شرح ذيل مي باشد كه اين عمل با استفاده از پييت مدرج استريل و يا رعايت شرايط سترون صورت مي گيرد

پس از تلقيح نمونه ههاي رقيق شده بر روي هر يك از پليت هاي استريل بر روي هر پليت محيط كشت كه قبلاً آماده كرده ايم ( N.A) ريخته و آن را با حركات 8 مانند زيگزاگي به هم مي زنيم تا كاملاً مخلوط شوند پس آنها را با ثبت مشخصات گروه در دماي به مدت 24 تا 48 ساعت در داخل انكوباتور گرما گذاري مي‌كنيم.

ب) عنوان آزمايش: تعيين PH و در صد رطوبت خاك براي اندازه گيري PH ابتدا 5 گرم از خاك را در داخل استوانه مدرج ( مزور) كه آب مقطر در داخل آن ريخته شده است و به داخل بشر مي ريزيم البته آب مقطر بايستي به آرامي روي خاك ريخته شود و با استفاده از ميله شيشه اي به هم مي زنيم و مي گذاريم تا كاملاً ته نشين شود و بعد با استفاده از PH متر آن را اندازه مي گيريم البته الكترود آن بيايستي به ته تشر بچسبد.

PH=7027

براي اندازه گيري رطوبت خاك 100g خاك را داخل يك بشر مناسب كه قبلاً وزن شده است اندازه مي گيريم :

X= وزن خاك+ وزن بشر

پس نمونه را با بشر به مدت 24 ساعت در دماي قرار مي دهيم و پس ازخارج كردن آن را وزن مي كنيم

درصد رطوبت خاك= 100 رطوبت خاك = وزن بشر با خاك - X

عنوان آزمايش: 1- مشاهده لام هاي دفن شده در خاك

2- شمارش و تعيين تعداد باكتريهاي هتروتروف هوازي در خاك

باكتريها به صورت اتفاقي در محيط وجود ندارد و بصورت تحمعي هستند و در خاك هم ترجيح مي دهند با استفاده از سطوحي كه در خاك وجود دارد در صورت امكان اطراف جمع شده و توده ها و تجمعاتي ايجاد كنند. به هر حال خاك نسبت به محيط سنتزي امكاناتش محدودتر است و كلونيهاي مشخص و بزرگي را كه روي يك محيط كشت ديده مي شود در خاك مشاهده نمي شود به همين جهت به آنها ميكروكلوني گفته مي شود يكي از روشهاي مطالعه ميكروبها در خاك استفاده از سطح مصنوعي در خاك و ايجاد ميكرو كلوني مي باشد كه اين عمل با استفاده از اسلايد‌هاي كليشه اي روي يك طرف لام كه ماده غذايي روي آن قرار داشته است را رنگي آميزي كرده و ميكروكلوني را مي بينيم. خارج كردن اسوايه با يستي به آرامي صورت بگيرد و توصيه اين است كه روي يك تكه روز نامه با يك ميله شيشه اي خاك اطراف اسلايد را كنار مي زنيم و پس از آزاد سازي آن را بيرون مي آوريم پس از آن يك لبه اسلايد كه به پارافيلم چسبيده گرفته و روي روزنامه بازتر ديگر ضربه مي زنيم به روي ميز تا خاكهاي به هم چسبيده جدا شوند پس پارافيلم را جدا كرده و سطح خارجي آغشته به سلولها و سطح داخلي كاملاً تميز است سطح داخلي ( تميز) : به منظور فيكس شدن سلولها سه بار روي شعله گرفته و فيكس مي كنيم و رنگ آميزي G انجام مي دهيم و پس از آن زير ميكروسكوپ مشاهده مي كنيم كه در نهايت قارچ ميسليوم قرمز ديده مي شود.

ياد آوري مراحل انجام رنگ امزي G : 1- كريستال ويوله 60 ثانيه 2- شستشو با آب مقطر 3- ايودين 60 ثانيه 4- شستشوي با آب مقطر 5- الكل واستن 6-5 ثانيه 6- سافرانين 45-30 ثانيه 7- شسشو با آب مقطر.

انواعي از تراكمها كه قابل مشاهده مي باشد: 1 - ريسه قارچها كه ميسليوم قارچي بوده وچون اولين رنگ را جذب مي كند آب مشاهده مي شود و بدليل اينكه و مختص باكتريها ست و قارچ پپتيد و گليكان ندارد كه در شكل ديواره عرض ميسليوم به شكل منشعب مي باشد و اگر به خوبي رشد كند اسپور آن به خوبي قابل مشاهده است

3- اكتينو ميستها كه باكتريهاي گرم مثبت و ظاهر رشته اي هستند و تقريباً شبيه ميسليوم قارچها مي باشند م مهمترين تفاوت آن اين است كه قطر رشته اي خيلي ظريف تر از قارچها مي باشد و قارچها قطورتر و منشعب تر هستند.

4- ويروسها كه ديده نمي شوند   5- گاهي اوقات اگر خاك خيلي مرطوب باشد پروتوزوئرها ديده مي شوند

ادامه كار هفته قبل:

پليت ها را به ترتيب افزايش دقت 1-تا 6- به ترتيب كوچك شدن قرار مي دهيم كه بايستي تراكم كلونيهاي رشد كرده كمي با شد و شمارش را با شيوه ذيل شروع مي كنيم البته بهترين روشهاي شمارش نيز خالي از خطا نمي باشد كه عبارت است از : الف) كم بودن رقت ها ( خطاي انساتي) ب) خود محيط كشت ممكن است براي همه باكتريها قابل استفاده نبوده باشد ج) اگر خطا ها را به حداقل برسانيم مي توانيم اين كار را با دقت بيشتر انجام داده و به نتيجه بهتر برسيم

لخوه شمارش: از مجموع پليت هاي كشت داده شده يكي را انتخاب مي كنيم و از قطر تراكمي كه بين 300-30 كلوني داشته باشد زيرا اگر كمتر از 30 تا باشد احتمال انتقال آلودگي محيط و بالعكس وجود دارد و قابل استناد نيست و اگر بيشتر از 300 مورد باشد ظرفيت ظرف بيش از آن نمي باشد. واحد شمارش آن C. . F.U

(Colony forming   uhit) و اساس آن بر اين است كه هر كلوني نماينده يك سلول مي باشد كه لازم آن جدا شدن سلولها از خاك با شرايط قابل قبول است اگر تعداد كلونيها را دقيق بشماريم مثل اين است كه تعداد سلولها را شمارش كرده ايم كه در بعضي آزمايشگاهها از دستگاه كلوني شمار (   Colony counter) استفاده مي شود . روي پليت نور مناسب تابيده شده و با استفاده از يك قلم الكترونيكي كلوني شمارش مي شود و قلم روي شيشه علامت گذاري كرده و احتمال شمارش مجدد از بين مي‌رود.

در روش دستي پشت پليت را با ماژيك وايت برد به چند قسمت تقسيم كرده و شمارش را از بالا پايين شروع مي كنيم البته يك خط را به صورت مشخص و قراردادي بايستي با خانه بالايي يا پايين محاسبه كرد و براي كاهش خطاها سه بار اين كار را انجام مي دهيم و ميانگين ميگيريم پليت انتخاب شده مربوط به    مي باشد

CFU       

عنوان آزمايش : 1- تهيه ميكروكالچر ( اسلايد كالچر ) يا ميكروكشت

هدف: تهيه نمونه مناسب براي مشاهده قارچ ريسه اي

تاريخ 10/12/83

ظاهركلوني كپك توده اي در هم رفته از ميسليوم قارچ مي باشد برداشتن يك ميسليوم و جداكردن آن مشكل مي باشد و روش اسلايه كالچه نمونه هاي ميكروسكوپي مناسب از كپكها تهيه مي شود و اصطلاحاً روش كشت روي لام نيز گفته مي شود كه در واقع قطعه اي از محيط كشت را روي يك لام ميكروسكوپي قرار داده و با پوشاندن آن كه قبلاً توسط محيط كشت تلقيح شده است قارچ از يك طرف چسبيده به محيط كشت مي دهد. بدين منظور ابتدا با چاقوي مخصوص به اندازه لازم به صورت چهارگوش در محيط كشت برش داده و با رعايت شرايط سترون بر روي لام قرار مي دهيم و به داخل پليت روي شيشه سه گوش مستقر مي كنيم ( محيط كشت مورد استفاده در اين روش SDA است) و سپس با رعايت شرايط لازم با استفاده از سوزن كه نوك آن را با استفاده از حرارت استريل مي كنيم قارچ را از محيط كشت قبلي برداشته و كناره هاي محيط كشت SDA روي لام به صورت SDA تلقيح مي كنيم كه نبايستي زياد برش بخورد چون زودتر خشك مي شود ولي اگر كمتر برش بخورد رشد نمي كند و اگر اندازه محيط كشت برداشتي خيلي كوچك باشد تبادل هوا مشكل و مقدار غذا كم مي‌باشد ولي اگر اندازه محيط كشت برداشتي مطلوب نخواهد بود سپس لامل را روي آن قرار داده و درب پليت را بسته و پس از اين مراحل پليت را به مدت يك هفته در درجه حرارت 27-25 درجه سانتي گراد ( دماي اتاق يا انكوباتور ) گرماگذاري مي‌كنيم البته بايستي قبل از اين عمل مقداري آب مقطر داخل پليت زير ميله سه گوش شيشه اي تلقيح كنيم تا رطوبت تعادل داشته باشد

عنوان آزمايش 2- MPN (Most Probable Number)  

هدف : آشنايي با روش استاندارد تعيين آلودگي ميكروبي آب

اين روش به منظور رد يابي و شناسايي و تعيين احتمالي آلودگي آب با فاضلاب مي‌باشد.

با اين آزمايش باكتريهايي كه منشأ آنها دستگاه گوارش انسان و جانواران خونگرم ميباشد در آب شناسايي كرد. آزمايش MPN از سه مرحله: احتمالي، تأييد و تكميلي تشكيل شده است . در مرحله احتمالي با توجه به نمونه و منشأ باكتري آلوده به كلي فرم باشد بررسي احتمال وجود مي باشد نمونه ها را در محيط كشت لاكتوز براث كشت مي دهيم دراين مرحله از لوث خص توليد اسيد و تغيير رنگ كه نشان دهنده مصرف قند لاكتوز توسط باكتريهاي كلي فرمي است و همچنين توليد گاز و جمع شدن آن در لوله دور هام ( لوله اي كوچك كه در داخل لوله آزمايش بصورت معكوس در داخل نمونه قرار داده مي شود) كه هر چند بالاتر باشد نشانگر فعاليت بيشتر باكتريها و تعداد بيشتر آنها مي باشد. البته در اين آزمايش از  L-T-B ( لوريل تريپتوبراث ) استفاده شده است.

روش كار:‌روش كار بدين صورت مي باشد كه ابتدا 9 لوله سه تايي را انتخاب كرده و به ترتيب در سه لوله اول به هر كدام از لوله ها با غلظت دو برابر از محيط كشت مي ريزيم و به سه لوله دوم از غلظت يك يا غلظتي كه توسط كارخانه سازنده اعلام شده است به هر كدام از لوله ها اضافه مي كنيم و به سه لوله سوم نيز مثل سه لوله دوم عمل مي كنيم سپس به سه لوله اول در شرايط سترون و كنار شعله با استفاده از پپيت استريل به هر كدام از نمونه آب را تلقيح مي كنيم سپس به سه لوله دوم به هر كدام از لوله ها cc 1 از نمونه آب به هر كدام از لوله ها اضافه مي نماييم لازم به ذكر است كه هنگام برداشت نمونه توسط پيپت و اضافه كردن آن داخل محيط كشت لوله هاي حاوي نمونه بايستي تكان داده شود تا باكتريها يكنواخت توزيع شده باشند. به سه لوله سوم از نمونه 1 در شرايط استريل و كنار شعله با پيپيت استريل اضافه كرده درب آن را با پنبه خودش مي بنديم و نمونه ها را به مدت 24 تا 48 ساعت در دماي گرماگذاري ( در داخل انكوباتور) مي كنيم. پس از مدت لازم و خوانده لوله ها مشاهده شد كه در سه لوله اول هر سه لوله تغيير رنگ و توليد گاز و در سه لوله دوم دو لوله و در سه لوله سوم هيچكدام رشد نداشته اند پس طبق جدول تعيين ميزان آلودگي MPN     3-2-o

كه عدد 5/9 مي باشد                                         95 =10 5/9

نتيجه اينكه در هر از نمونه آب 95 نمونه كلي فردي

نوع آزمايش : مشاهده لام هاي قارچي تهيه شده به روش اسلايد كالچر

هدف: تعيين نوع قارچ رشد كرده زير لامل با رنگ آميزي ساده

برای دیدن قسمت های دیگر این تحقیق لطفا" از منوی جستجوی سایت که در قسمت بالا قرار دارد استفاده کنید. یا از منوی سایت، فایل های دسته بندی رشته مورد نظر خود را ببینید.

لینک متن کامل

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *