گزارشات آزمایشات میكروبیولوژی محیطی – قسمت اول

 

عنوان آزمایش : 1- جمع آوری و نگهداری نمونه های خاك

2 – تهیه لام های دفن شده در خاك

آشنایی با روش نمونه برداری، نگهداری و تهیه لام از خاك

میكرو بیولوژی و شیمی خاك حایز اهمیت می باشند كه بر اساس اصول صحیح جمع آوری و نگهداری كرده و آزمایش مورد نظر را انجام می دهیم نكته مهم اینكه خاك از جمله محیطهایی است كه حتی در یك محدوده معین ویژگیها و شرایط آن از نظر فیزیكی- بیولوژیك و شیمیایی با همدیگر فرق دارند. مثلاً در یك محدوده خاص مثل بلندی تپه در مقایسه با ارتفاع كم ویژگیهای متفاوت می باشد و حتی در یك باغچه كه به آن كود داده می شود جاهایی كه كود بیشتری دریافت كرده و یا كمتری دریافت كرده شرایط متفاوتی دارد، بنابراین تهیه این نمونه ها یا به منظور انجام آزمایشهایی میكرولوژی انجام می شود و یا آزمایشهای شیمیایی كه این دو تفاوتی كوچك از نظر جمع اوری و نگهداری دارند. برای نمونه برداری و جمع آوری از دستگاههای نمونه بردار خاصی آگلر استفاده می شود كه غالباً نوعی لوله نمونه برداری است كه طول و قطر مشخص دارد و جنس آن عموماً فلزی می باشد و ویژگی كه دارند روی سطح آنها مدرج شده است كه به منظور اندازه گیری از عمق مورد استفاده قرار می گیرد كه به شكل عمودی بر روی نقطه ای كه برای برداشت نمونه مشخص شده است قرار گرفته است و با فشار دادن دست یا فشارمكانیكی در خالك فرورفته تا عمق مورد نظر ازخاك پر می شوند و بعد محتویات آنها با یك ظرف ترجیحاً استریل یا یك كیسه پلاستیكی منتقل می شوند.

نکته مهم : برای استفاده از متن کامل تحقیق یا مقاله می توانید فایل ارجینال آن را از پایین صفحه   کنید. سایت ما حاوی تعداد بسیار زیادی مقاله و تحقیق دانشگاهی در رشته های مختلف است که می توانید آن ها را به رایگان   کنید

مرحله دوم نگهداری نمونه ها می باشد كه اگر مجبور به نگهداری شویم بایستی نمونه های جمع آوری شده در شرایطی كه از نظر دما و رطوبت تشابه زیادی با زمان برداشت نمونه دارند نگهداری شوند كه مثلاً در مورد نمونه های میكروبی دمای مشابه دمای برداشت نمونه مناسب بوده كه فعالیت میكرو ارگانسیم ها را كند می كند در مورد آزمایشهای شیمیایی روشهایی مانند منجمد كردن و خشك كردن برای نگهداری مورد نظر می باشد .

مرحله انجام آزمایش:

برای شروع كار ابتدا یك نقطه مناسب را برای برداشت نمونه در نظر می گیریم و در مرحله اول باید یك برچسب تهیه كرده و مشخصات دقیق محل برداشت نمونه را روی آن برچسب می نویسیم یعنی اینكه اگر برای برداشت مجدد نیاز باشد بایستی بتوانیم نمونه برداری را عیناً تكرار كنیم كه بتدریج فناوریهای جدید مثل   GPS نیز مورد استفاده قرار می گیرد در درجه دوم مشخصات ظاهری خاك را بایستی یادداشت كنیم كه شامل: نوع دانه بندی خاك- پستی و یا بلندی – خشكی و دیگر مشخصات و بعد از مدتی كه مراجعه كردیم متوجه تغییرات آن شویم معمولاً این برچسبها حاوی تاریخ، شرایط اقلیمی، نام نمونه بردار و هر اطلاعات دیگری كه لازم بوده و به تفسیر نتایج آزمایش كمك كند می باشد.

انجام آزمایش:

پس از تحویل گرفتن وسایل مورد نیاز شامل یك كیسه نایلون تمیز و دماسنج و تیغه محل نمونه برداری پشت آزمایشگاه كنار درخت بزرگ زبان گنجشك و قسمت شمال غربی آن تعیین گردید و ضمن مراجعه در محل با استفاده از لوله مخصوص كه برای نمونه برداری پیش بینی شده بود با فشار مكانیكی در محل مورد نظر اقدام به نمونه برداری و تخلیه آن داخلا یك پلاستیكی گردید البته قبلاً با استفاده از دما سنج مخصوص و با فرو كردن آن در داخل و ایست چند دقیقه ای درجه حرارت خاك تعیین گردید سپس درجه حرارت هوا نیز اندازه گیری و بود. پس از ثبت مشخصات شامل 1- نام نمونه بردار: علی اكبر نوروزی 2- ساعت 15/15 روز دوشنبه 3/12/84 3- مكان: آموزشكده محیط زیست پشت آزمایشگاه میكرولوژی جنب درخت بزرگ زبان گنجشك و قسمت شمالی آن 4- درجه حرارت هوا 5- درجه حرارت خاك 6- شرایط اقلیمی : هوا مرطوب و پس از حدود ده ساعت بارندگی متناوب

در مرحله بعد از تحویل گرفتن یك عدد بوكال ( وسیله قراردادن خاك و لام ها و تماس آنها با همدیگر به منظور ایجاد تماس مناسب محیط كشت با خاك) و 6 عدد لام یا اسلاید كه با استفاده از میكروفیلم آنها را به هم چسباند هو نفوذ ناپذیری آن را تضمین می كنیم كه یك طرف آنها را با سواپ كه قبلاً با استفاده از محیط كشت نوترینت براث (NB) آغشته می كنیم ( در شرایط استریل)

پس از آماده كردن سه عدد اسلاید دو طرفه كه یك طرف آن آغشته به محیط كشت NB  می باشد آنها را با فاصله در داخل بوكال قرار می دهیم و سپس با استفاده از قاشقك میان آنها را با آرامی با خاك پر می نماییم و درب بوكال را بسته و در دمای گرما گذاری می كنیم كه اگر شرایط دمای اطاق این باشد مطلوب است در غیر اینصورت آن را داخل انكوباتور به مدت دو هفته قرار می دهیم تا میكروارگانیم ها روی آن رشد كند.

عنوان آزمایش: الف) شمارش باكتریهای هتروتروف هوازی خاك به روش plate

count

هدف: آشنایی با روش كلاسیك شمارش باكتریهای زنده

تاریخ: 10/12/84

انجام آزمایش:

باكتریها غالبترین جمعیت میكروارگانیم های خاك را تشكیل می دهند و در خاكهای معمولی بین عدد در هر گرم خاك موجود می باشند در خاكهای فاضلاب و لجن فعال یا كشاورزی یا كود دهی بالا با میكروبی بالایی دارند.

استفاده از رفتهای متوالی و كشت در پلیت به روش pour plate می باشد خاك بدلیل اینكه دارای باكتریهای زیادی می باشد قابل كشت بصورت مستقیم نمی باشد لذا ابتدا سوسپانیون را تهیه و با استفاده از مایع مناسب كه آسیبی به سلولها نرساند ماده جامد را وارد آن می كنیم و با استفاده از روشهای مكانیكی آن را به هم می زنیم یا با استفاده از دستگاهی بنام shaker كه با دور مشخص ( مثلاً 2000RPM یادویست دور در دقیقه ) به مدت ده دقیقه كه سلولها به هم چسبیده جدا و معلق شوند البته این روش علاوه بر خاك در مواد غذایی نیز مورد استفاده دارد . روش مناسب دقیق سازی تهیه وقتهای متوالی است كه مایع مناسب برای آن سرم فیزیولوژیك یا آب مقطر می باشد.

دقت                       (خاك) سرم فیزیولوژیك

كه به ازای هر رقت یك پلیت خالی استریل در نظر می گیریم البته صحیح آن 3 دست برای هر لوله می باشد كه به شرح ذیل می باشد كه این عمل با استفاده از پییت مدرج استریل و یا رعایت شرایط سترون صورت می گیرد

پس از تلقیح نمونه ههای رقیق شده بر روی هر یك از پلیت های استریل بر روی هر پلیت محیط كشت كه قبلاً آماده كرده ایم ( N.A) ریخته و آن را با حركات 8 مانند زیگزاگی به هم می زنیم تا كاملاً مخلوط شوند پس آنها را با ثبت مشخصات گروه در دمای به مدت 24 تا 48 ساعت در داخل انكوباتور گرما گذاری می‌كنیم.

ب) عنوان آزمایش: تعیین PH و در صد رطوبت خاك برای اندازه گیری PH ابتدا 5 گرم از خاك را در داخل استوانه مدرج ( مزور) كه آب مقطر در داخل آن ریخته شده است و به داخل بشر می ریزیم البته آب مقطر بایستی به آرامی روی خاك ریخته شود و با استفاده از میله شیشه ای به هم می زنیم و می گذاریم تا كاملاً ته نشین شود و بعد با استفاده از PH متر آن را اندازه می گیریم البته الكترود آن بیایستی به ته تشر بچسبد.

PH=7027

برای اندازه گیری رطوبت خاك 100g خاك را داخل یك بشر مناسب كه قبلاً وزن شده است اندازه می گیریم :

X= وزن خاك+ وزن بشر

پس نمونه را با بشر به مدت 24 ساعت در دمای قرار می دهیم و پس ازخارج كردن آن را وزن می كنیم

درصد رطوبت خاك= 100 رطوبت خاك = وزن بشر با خاك – X

عنوان آزمایش: 1- مشاهده لام های دفن شده در خاك

2- شمارش و تعیین تعداد باكتریهای هتروتروف هوازی در خاك

باكتریها به صورت اتفاقی در محیط وجود ندارد و بصورت تحمعی هستند و در خاك هم ترجیح می دهند با استفاده از سطوحی كه در خاك وجود دارد در صورت امكان اطراف جمع شده و توده ها و تجمعاتی ایجاد كنند. به هر حال خاك نسبت به محیط سنتزی امكاناتش محدودتر است و كلونیهای مشخص و بزرگی را كه روی یك محیط كشت دیده می شود در خاك مشاهده نمی شود به همین جهت به آنها میكروكلونی گفته می شود یكی از روشهای مطالعه میكروبها در خاك استفاده از سطح مصنوعی در خاك و ایجاد میكرو كلونی می باشد كه این عمل با استفاده از اسلاید‌های كلیشه ای روی یك طرف لام كه ماده غذایی روی آن قرار داشته است را رنگی آمیزی كرده و میكروكلونی را می بینیم. خارج كردن اسوایه با یستی به آرامی صورت بگیرد و توصیه این است كه روی یك تكه روز نامه با یك میله شیشه ای خاك اطراف اسلاید را كنار می زنیم و پس از آزاد سازی آن را بیرون می آوریم پس از آن یك لبه اسلاید كه به پارافیلم چسبیده گرفته و روی روزنامه بازتر دیگر ضربه می زنیم به روی میز تا خاكهای به هم چسبیده جدا شوند پس پارافیلم را جدا كرده و سطح خارجی آغشته به سلولها و سطح داخلی كاملاً تمیز است سطح داخلی ( تمیز) : به منظور فیكس شدن سلولها سه بار روی شعله گرفته و فیكس می كنیم و رنگ آمیزی G انجام می دهیم و پس از آن زیر میكروسكوپ مشاهده می كنیم كه در نهایت قارچ میسلیوم قرمز دیده می شود.

یاد آوری مراحل انجام رنگ امزی G : 1- كریستال ویوله 60 ثانیه 2- شستشو با آب مقطر 3- ایودین 60 ثانیه 4- شستشوی با آب مقطر 5- الكل واستن 6-5 ثانیه 6- سافرانین 45-30 ثانیه 7- شسشو با آب مقطر.

انواعی از تراكمها كه قابل مشاهده می باشد: 1 – ریسه قارچها كه میسلیوم قارچی بوده وچون اولین رنگ را جذب می كند آب مشاهده می شود و بدلیل اینكه و مختص باكتریها ست و قارچ پپتید و گلیكان ندارد كه در شكل دیواره عرض میسلیوم به شكل منشعب می باشد و اگر به خوبی رشد كند اسپور آن به خوبی قابل مشاهده است

3- اكتینو میستها كه باكتریهای گرم مثبت و ظاهر رشته ای هستند و تقریباً شبیه میسلیوم قارچها می باشند م مهمترین تفاوت آن این است كه قطر رشته ای خیلی ظریف تر از قارچها می باشد و قارچها قطورتر و منشعب تر هستند.

4- ویروسها كه دیده نمی شوند   5- گاهی اوقات اگر خاك خیلی مرطوب باشد پروتوزوئرها دیده می شوند

ادامه كار هفته قبل:

پلیت ها را به ترتیب افزایش دقت 1-تا 6- به ترتیب كوچك شدن قرار می دهیم كه بایستی تراكم كلونیهای رشد كرده كمی با شد و شمارش را با شیوه ذیل شروع می كنیم البته بهترین روشهای شمارش نیز خالی از خطا نمی باشد كه عبارت است از : الف) كم بودن رقت ها ( خطای انساتی) ب) خود محیط كشت ممكن است برای همه باكتریها قابل استفاده نبوده باشد ج) اگر خطا ها را به حداقل برسانیم می توانیم این كار را با دقت بیشتر انجام داده و به نتیجه بهتر برسیم

لخوه شمارش: از مجموع پلیت های كشت داده شده یكی را انتخاب می كنیم و از قطر تراكمی كه بین 300-30 كلونی داشته باشد زیرا اگر كمتر از 30 تا باشد احتمال انتقال آلودگی محیط و بالعكس وجود دارد و قابل استناد نیست و اگر بیشتر از 300 مورد باشد ظرفیت ظرف بیش از آن نمی باشد. واحد شمارش آن C. . F.U

(Colony forming   uhit) و اساس آن بر این است كه هر كلونی نماینده یك سلول می باشد كه لازم آن جدا شدن سلولها از خاك با شرایط قابل قبول است اگر تعداد كلونیها را دقیق بشماریم مثل این است كه تعداد سلولها را شمارش كرده ایم كه در بعضی آزمایشگاهها از دستگاه كلونی شمار (   Colony counter) استفاده می شود . روی پلیت نور مناسب تابیده شده و با استفاده از یك قلم الكترونیكی كلونی شمارش می شود و قلم روی شیشه علامت گذاری كرده و احتمال شمارش مجدد از بین می‌رود.

در روش دستی پشت پلیت را با ماژیك وایت برد به چند قسمت تقسیم كرده و شمارش را از بالا پایین شروع می كنیم البته یك خط را به صورت مشخص و قراردادی بایستی با خانه بالایی یا پایین محاسبه كرد و برای كاهش خطاها سه بار این كار را انجام می دهیم و میانگین میگیریم پلیت انتخاب شده مربوط به    می باشد

CFU       

عنوان آزمایش : 1- تهیه میكروكالچر ( اسلاید كالچر ) یا میكروكشت

هدف: تهیه نمونه مناسب برای مشاهده قارچ ریسه ای

تاریخ 10/12/83

ظاهركلونی كپك توده ای در هم رفته از میسلیوم قارچ می باشد برداشتن یك میسلیوم و جداكردن آن مشكل می باشد و روش اسلایه كالچه نمونه های میكروسكوپی مناسب از كپكها تهیه می شود و اصطلاحاً روش كشت روی لام نیز گفته می شود كه در واقع قطعه ای از محیط كشت را روی یك لام میكروسكوپی قرار داده و با پوشاندن آن كه قبلاً توسط محیط كشت تلقیح شده است قارچ از یك طرف چسبیده به محیط كشت می دهد. بدین منظور ابتدا با چاقوی مخصوص به اندازه لازم به صورت چهارگوش در محیط كشت برش داده و با رعایت شرایط سترون بر روی لام قرار می دهیم و به داخل پلیت روی شیشه سه گوش مستقر می كنیم ( محیط كشت مورد استفاده در این روش SDA است) و سپس با رعایت شرایط لازم با استفاده از سوزن كه نوك آن را با استفاده از حرارت استریل می كنیم قارچ را از محیط كشت قبلی برداشته و كناره های محیط كشت SDA روی لام به صورت SDA تلقیح می كنیم كه نبایستی زیاد برش بخورد چون زودتر خشك می شود ولی اگر كمتر برش بخورد رشد نمی كند و اگر اندازه محیط كشت برداشتی خیلی كوچك باشد تبادل هوا مشكل و مقدار غذا كم می‌باشد ولی اگر اندازه محیط كشت برداشتی مطلوب نخواهد بود سپس لامل را روی آن قرار داده و درب پلیت را بسته و پس از این مراحل پلیت را به مدت یك هفته در درجه حرارت 27-25 درجه سانتی گراد ( دمای اتاق یا انكوباتور ) گرماگذاری می‌كنیم البته بایستی قبل از این عمل مقداری آب مقطر داخل پلیت زیر میله سه گوش شیشه ای تلقیح كنیم تا رطوبت تعادل داشته باشد

عنوان آزمایش 2- MPN (Most Probable Number)  

هدف : آشنایی با روش استاندارد تعیین آلودگی میكروبی آب

این روش به منظور رد یابی و شناسایی و تعیین احتمالی آلودگی آب با فاضلاب می‌باشد.

با این آزمایش باكتریهایی كه منشأ آنها دستگاه گوارش انسان و جانواران خونگرم میباشد در آب شناسایی كرد. آزمایش MPN از سه مرحله: احتمالی، تأیید و تكمیلی تشكیل شده است . در مرحله احتمالی با توجه به نمونه و منشأ باكتری آلوده به كلی فرم باشد بررسی احتمال وجود می باشد نمونه ها را در محیط كشت لاكتوز براث كشت می دهیم دراین مرحله از لوث خص تولید اسید و تغییر رنگ كه نشان دهنده مصرف قند لاكتوز توسط باكتریهای كلی فرمی است و همچنین تولید گاز و جمع شدن آن در لوله دور هام ( لوله ای كوچك كه در داخل لوله آزمایش بصورت معكوس در داخل نمونه قرار داده می شود) كه هر چند بالاتر باشد نشانگر فعالیت بیشتر باكتریها و تعداد بیشتر آنها می باشد. البته در این آزمایش از  L-T-B ( لوریل تریپتوبراث ) استفاده شده است.

روش كار:‌روش كار بدین صورت می باشد كه ابتدا 9 لوله سه تایی را انتخاب كرده و به ترتیب در سه لوله اول به هر كدام از لوله ها با غلظت دو برابر از محیط كشت می ریزیم و به سه لوله دوم از غلظت یك یا غلظتی كه توسط كارخانه سازنده اعلام شده است به هر كدام از لوله ها اضافه می كنیم و به سه لوله سوم نیز مثل سه لوله دوم عمل می كنیم سپس به سه لوله اول در شرایط سترون و كنار شعله با استفاده از پپیت استریل به هر كدام از نمونه آب را تلقیح می كنیم سپس به سه لوله دوم به هر كدام از لوله ها cc 1 از نمونه آب به هر كدام از لوله ها اضافه می نماییم لازم به ذكر است كه هنگام برداشت نمونه توسط پیپت و اضافه كردن آن داخل محیط كشت لوله های حاوی نمونه بایستی تكان داده شود تا باكتریها یكنواخت توزیع شده باشند. به سه لوله سوم از نمونه 1 در شرایط استریل و كنار شعله با پیپیت استریل اضافه كرده درب آن را با پنبه خودش می بندیم و نمونه ها را به مدت 24 تا 48 ساعت در دمای گرماگذاری ( در داخل انكوباتور) می كنیم. پس از مدت لازم و خوانده لوله ها مشاهده شد كه در سه لوله اول هر سه لوله تغییر رنگ و تولید گاز و در سه لوله دوم دو لوله و در سه لوله سوم هیچكدام رشد نداشته اند پس طبق جدول تعیین میزان آلودگی MPN     3-2-o

كه عدد 5/9 می باشد                                         95 =10 5/9

نتیجه اینكه در هر از نمونه آب 95 نمونه كلی فردی

نوع آزمایش : مشاهده لام های قارچی تهیه شده به روش اسلاید كالچر

هدف: تعیین نوع قارچ رشد كرده زیر لامل با رنگ آمیزی ساده

برای دیدن قسمت های دیگر این تحقیق لطفا” از منوی جستجوی سایت که در قسمت بالا قرار دارد استفاده کنید. یا از منوی سایت، فایل های دسته بندی رشته مورد نظر خود را ببینید.

لینک متن کامل

Leave a comment