گزارشات آزمایشات میكروبیولوژی محیطی – قسمت دوم

 

لاكتوفنل كاتن بلو

برای رنگ آمیزی لاملها یك قطره رنگ آمیزی مخصوص قارچها ( لاكتوز فنل كاتن بلو) كنار دست گذاشته و در كنار شعله پلیت را روی سكو قرار می‌دهیم و گوشه پلیت را باز كرده و با پنس یك ضربه كوچك به داخل زده و با همان پنس لامل را برداشته و از سمتی كه میسلیوم به لام چسبیده داخل رنگ می‌گذاریم و 20 تا 30 ثانیه صبر می‌كنیم و لام را زیر میكروسكوپ قارچ مورد نظر مطالعه می‌كنیم. پس از مشاهده زیر میكروسكوپ و تطبیق آن با جدول پیوست مشاهده گردید كه مودر شماره 14 Oospora یا Ceotvichum در زیر لامل رشد نموده است.

نکته مهم : برای استفاده از متن کامل تحقیق یا مقاله می توانید فایل ارجینال آن را از پایین صفحه   کنید. سایت ما حاوی تعداد بسیار زیادی مقاله و تحقیق دانشگاهی در رشته های مختلف است که می توانید آن ها را به رایگان   کنید

عنوان آزمایش: مرحله تاییدی MPN

هدف: تایید یا عدم تایید وجود آلودگی در نمونه، آبی

در این مرحله از محیط كشت‌های اختصاصی از EMB استفاده می‌كنیم كه اختصاصی و هم افتراقی است دلیل اختصاصی‌ایی است كه باكتریهای G+ اجازه رشد نداده و مخصوص G هاست و به این دلیل افتراقی است كه كلونیهای را تشكیل می‌دهند تا نسبتاً بزرگ، شل و آبكی و یك مركز تیره رنگ دارند و از همه مهمتر اینكه اگر خود E.Coil باشد تصویر رنگ سبز جلای فلزی درخشان می‌باشد در صورتی كه در سایر باكتریها این طور نیست.

  • qتعیین Fecal Coliform

روش عمل: در این مرحله به تعداد لوله‌های مثبت شده لوله آزمایش انتخاب كرده و در آن محیط كشت E.C.Broth داخل آن قرار داده و روی سه لوله اول كه برای سه لوله مثبت شده مورد نظر قرار داده و عدد 10 را ثبت می‌كنیم و برای دو لوله بعدی كه برای لوله‌های مثبت شده سه لوله دوم در نظر گرفته می‌شود عدد 1 ثبت می‌كنیم و در كنار شعله و در شرایط ستورن در كنار شعله با استفاده از لوپ به شرح فوق در لوله‌ها تلقیح می‌كنیم و در دمای به مدت 24 ساعت در انكوباتور گرماگذاری می‌كنیم.

طبق مشاهده و قرائت نتیجه 3     1   0

در صد میلی لیتر نمونه وجود دارد 10 = 45 ×4.5

عنوان آزمایش: مرحله تكمیلی MPN

هدف: مشاهده تفكیكی كلی فرمها

در این مرحله دو تا از لوله‌های مثبت شده مرحله قلا مرحله تاییدی را انتخاب كرده و با كمك لوپ روی دو تا محیط كشت یكی كشت مجدد از كلونی‌هایی كه بزرگ بوده و مركز تیره دارند كه این كشت در لوله حاوی L . B صورت می‌گیرد و لوله دوم كه در لوله شیب دار N.A از كلونیهای دارای مشخصات كلی فرمی تلقیح می‌كنیم پس آنها را به مدت 24 ساعت در درجه حرارت گرما گذاری می‌كنیم در مشاهده اسمیر تهیه شده و رنگ آمیزی شده از محیط NA با سیلهای گرم منفی بدون اسپور () تایید گردید.

اثر شیاكلی دارای مشخصات: لزج، جلای فلزی، كلونی كوچك می‌باشد.

در پایان مرحله تكمیلی اگر هدف شناسایی باكتری با استفاده از محیط شیب دار مورد نظر باشد وارد تستهای بیوشیمیایی می‌شویم. برای این تستها بایستی كشت خالص داشته باشیم ( حداقل دو گونه باكتری ) اگر خالص نباشد تستهای بیوشیمایی با كلید راهنما نمی‌تواند تستهای بیوشیمیایی با روش IMViC انجام می‌شود.

عنوان آزمایش: روش صافی غشایی

هدف: تعیین آلودگی آب

در استفاده از روش ضافی غشایی از صافی‌هایی استفاده می‌شود كه قطر منافذ آنها از قطر باكتریها كمتر است وقتی نمونه مورد نظر از صافی بگذرد باكتریها روی ضافی را اگر روی پلیت حاوی محیط كشت بگذاریم رشد خواهد كرد.

در این روش از دستگاه ویژه‌ای استفاده می‌شود كه شامل سه قسمت می‌باشد یكی قیف كه فیلتر در درون آن قرار می‌گیرد دوم پایه نگهدارنده و ارلن خلأ یا تخلیه كه با یك شلنگ به پمپ خلأ وصل می‌شود كه به غیر از پمپ سایر اجزاء بایستی استریل باشد برای این كار قبلاً با یك تكه آلومینیوم كاغذ فویل آلومینیومی می‌پوشانیم و همه اجزاء را داخل اتوكلا قرار می‌دهیم و نزدیك شعله پس از استریل كردن بر روی هم سوار می‌كنیم. البته بهتر است فیلتر را داخل گذاشته و سپس استریل كنیم پوشش روی آن را وقتی بر می‌داریم كه خواهیم آب را صاف كنیم. اگر آب كدورت بالایی داشته باشند ما مجبور به روشن كردن پمپ می‌باشیم پس از این مرحله آب داخل ارلن را جمع می‌كنیم و در كنار شعله اجزای دستگاه را جدا می‌كنیم و پنس را داخل الكل قرار داده و كنار شعله استریل كرده و فیلتر را برداشته و به همان شكل داخل محیط كشت قرار داده و در داخل اتكوباتور به مدت 25 ساعت در دمای گرماگذاری می‌كنیم برای این روش معمولاً محیط كشتی را انتخاب می كنیم كه نیمه جامد بوده و آثار كمتری داشته باشد كه سریعتر جذب فیلتر شود. اگر باكتریها واقعاً وجود داشته باشند پس از 24 ساعت گرماگذاری روی فیلتر كلی فرمها قابل مشاهده و شمارش هستند البته حجم آب بایستی مشخص باشد. روش صافی سریعتر از روش MPN می‌باشد بدین صورت كه در روش صافی غشایی تا 24 ساعت نتیجه مشخص می‌شود در صورتی كه در روش MPN سه تا چهار روز نتیجه طول می‌كشد. فایده روش ضافی سرعت عمل آن می‌باشد و عیب آن این است كه در مورد آبهای تصفیه شده راحت می‌باشد ولی در مورد آب رودخانه كه هم كه مدت و هم تنوع باكتریها بالاست ممكن است سطح فیلتر برای باكتری مناسب باشد و یا نامناسب بوده و پاره می‌شود كه البته متداولترین روش برای آبهای تصفیه شده است.

عنوان آزمایش: تست IMViC

هدف: تشخیص باكتریهای اشر شیاكلی، انتروباكتر و كلبسیلا در آب آلوده نمونه

ویژگیهای درون سلول یعنی توانایی متابولیسمی و آنزیمی سلول چون جنسهای مختلف و گونه‌های مختلف واكنشهای متابولیسمی متفاوتی دارند مثلاً حتی یك جنس واحد یك گونه می تواند از یك ماده غذایی خاص استفاده كند ولی اگر نتواند یك گونه دیگر است.

راه تشخیص: همان اتفاقی كه در درون سلول می‌افتد با استفاده از مواد شیمیایی به نوعی قابل مشاهده كنیم.

تفاوت آنزیمها را به تستهایی كه تستهای بیوشیمیایی گفته می‌شود اندازه‌گیری و مشخص می‌كنند مثلاً اگر میكروارگانیسمی الیه تولید كند می‌توان از راه سنجش PH آن را اندازه‌گیری كرد.

در مورد كلی فرمها یك باكتری مجهول را شناسایی و در اولین كار رنگ آمیزی G می‌كنیم اگر G+ باشد شامل كوكی و با سیل و G شامل كولی و باسیل می‌باشد باسیل G از خانواده كلی فرمسهاست. یك آزمایش اختصاصی بیوشیمیایی G باسیل وجود دارد كه به آن آزمون IMViC گفته می‌شود كه اختصاصی كلی فرمهاست. چهار تست شیمیایی مجموع IMViC را تشكیل می‌دهند كه برای تشخیص جنس و گونه‌های كلی فرمها به كار می‌رود. این تست برای شناسایی تمام جنس این گونه ها و خانواده‌ها كافی نیست اما باكتری كه مورد نظر و جستجوی ماست یكی از سه باكتری 1- اشر شیاكلی E-Coli 2- انتروباكتر E.Bacter 3- كلبسیلا می‌باشد كه هر سه باكتری روده‌ای و از مهمترین كلی فرما هستند. این تست برای تشخیص این سه گونه كفایت می‌كند بخصوص جواب این آزمون برای جستهای انتروباكتروكلبسیلا كاملاً یكسان است به همین خاطر بر اساس آزمون IMViC و به خاطر قشا به در یك گروه به نام گروه انتروباكتركلبسیلا نامیده می‌شود كه اگر بخواهیم جداسازی بكنیم بایستی سراغ تستهای دیگری برویم.

روش كار قسمت IMViC :

1) بررسی توانایی استفاده ایندول سلول توسط باكتری از اسید آمینه تریپتوفان استفاده می‌شود برای این امر از معرف شیمیایی به نام كواكس استفاده می‌كنیم كه اگر اندول وجود داشته باشد تركیب شده و رنگ قرمز رنگ تولید می‌كند و اگر وجود نداشته باشد تغییر رنگ نداده و زرد رنگ است.

اساس كار به این صورت است كه در محیط كشت SIM(A) كه نیمه آگار است به صورت عمقی در داخل لوله باكتری مورد نظر را به شكل عمقی با كمك سوزن در امتداد یك خط به شكل عمقی كشت می‌دهیم و به مدت 24 ساعت در دمای در داخل انكوباتور گرماگذاری می‌كنیم و پس از آن 10-5 قطره معرف كواكس را روی آن می‌ریزیم و 15 دقیقه صبر می‌كنیم اگر مثبت باشد قرمز هاله‌ای تشكیل می‌شود و اگر منفی باشه هاله زرد رنگ می‌باشد. ] پس از انجام مشاهده شد كه قرمز شده است.[

2) آزمون بعدی (M) متیل رد می‌باشد كه دو تا تست در این آزمون انجام می‌دهیم كه با استفاده از یك محیط كشت باشد این محیط كشت مایع MRVP می‌باشد كه وجود مواد كه بنی و قندی در آن كه تعدادی از باكتریها می‌توانند این مواد را معرف و مقدار زیادی رسید تولید كنند و PH محیط را تا 4 – 4.5 پایین بیاورند. معرف متیل رد را كه اسیدی است قرمز رنگ می‌كند كه نشانگر وجود باكتری است. اگر تركیبات كربن دار هم معرف شوند PH = 4.5 و متیل رد قرمز رنگ می‌شود ولی اگر كم مصرف شود PH=6 و متیل رد زرد به رنگ چركی می‌شود درجه حراست و به مدت 24 ساعت برای گرماگذاری در این مرحله لازم است. ] پس از انجام مشاهده شد كه قرمز رنگ شده است [.

3) لوله دوم در آزمون بعدی آزمون تست VP همان باكتری را در همان محیط كشت می‌دهیم و بعضی باكتریها تمام قند موجود در محیط را نمی‌توانند مصرف كنند و سایر تركیبات را مصرف می‌كنند و از جمله فرآورده‌هایی را كه تولید می‌كنند استیل متیل كابینول می‌باشد این ماده اگر با یك ماده شیمیایی به نام باریت تركیب شود یك رنگ قرمز ایجاد می‌كند اما اگر در محیط نباشد تقریباً‌ زرد چركی ایجاد می‌شود. اساس كار در این مرحله اضافه كردن معرف پس از گرماگذاری 24 ساعته در درجه حرارت می‌باشد كه ابتدا 10 قطره محلول A و پس از یك الی دو دقیقه هم زدن 10 قطره محلول B را اضافه می‌كنیم و هم می‌زنیم تا تركیب شود سپس 15 دقیقه صبر می‌كنیم كه اگر رنگ قرمز رنگ شود VP مثبت است ولی اگر زرد رنگ شود VP منفی است ] پس از انجام مشاهده شد كه رنگ زرد می‌باشد.[

4) در مرحله چهارم از محیط كشت خامی به نام سیمون سیترات آگار (SCA) كه سبز رنگ می‌باشد استفاده می‌شود كه یك محیط كشت اختصاصی و تنها ماده كربنی و انرژی موجود در آن سیترات سدیم می‌باشد. بعضی از باكتریهای مورد جستجو می‌توانند سیترات سدیم را به عنوان تنها منبع تغذیه‌ای استفاده كنند پس رشد می‌كنند اما اگر باكتری داشته باشیم كه نتواند آن را استفاده كند نمی‌تواند رشد كند كه راه تشخیص الف) تشكیل كلونی. ب) تولید تركیبات اسیدی كه رنگ محیط كشت را عوض می‌كند و اگر رشد كند رنگ محیط را آبی می‌كنند ولی اگر رشد نكنند رنگ محیط كشت تغییری نكرده و سبز می‌ماند در این مرحله كه احتیاجی به معرف برای تشخیص نهایی نمی‌باشد به مدت 24 ساعت در دمای گرماگذاری پس از تلقیح لازم است ( معرف موجود در داخل محیط كشت برموتیمول بلو است).

در پایان مراحل IMViC

D       M       VP     C

+       +         –         –

و با توجه به مثبت بودن I باكتری مورد نظر رشد شیاكلی تشخیص داده شد.

( اگر انتروباكتروكلبسیا باشد

I      M       VP     C

–       –         +       +

عنوان آزمایش: تعیین دانستیه میكروبی هوا

هدف: تعیین میازن تراكم باكتریها و قارچها در هوای یك محیط بسته هوا زیستگاه هیچ میكروارگانیسمی نیست چون شرایط زیستی شامل رطوبت ثابت مواد غذایی و عدم تغییر و تحول كافی نمی‌باشد اما مهترین محیط نقل و انتقال میكروارگانسم‌ها می‌باشد كه برای تعیین كارآمدی سیستم‌های تهویه در محیط‌های بسته مثل بیمارستانها استفاده می‌شود.

محل مورد آزمایش نباید آقتاب گیر بوده و در معرض جریان باد كولر یا بخاری باشد و حداقل نیم متربا با زمین فاصله داشته باشد. با رعایت شرایط فوق مهل روی میز آزمایشگاه در نظر گرفته شد و درب پلیت‌ها (دوپلیت‌ها) را به مدت 30 دقیقه كه یكی حاوی محیط كشت N .A می‌باشد كه محیط كشت مشترك باكتریها و قارچها می‌باشد و یكی حاوی محیط كه محیط كشت مشترك باكتریها و قارچها می‌باشد و یكی حاوی محیط كشت N . A می‌باشد كه محیط كشت مشترك باكتریها و قارچها می‌باشد یكی حاوی محیط كشت SDA كه اختصاصی برای قارچها می‌باشد را باز می‌گذاریم. به این دلیل بیشتر از 30 دقیقه باقی نمی‌گذاریم كه آب محیط كشت تبخیر می‌شود. پس از این مرحله هر دو محیط كشت را به مدت 24 ساعت و در دمای گرماگذاری می‌كنیم.

برای تعیین باكتریها و قارچها از فرمول‌های خاصی استفاده می‌شود:

تعدادكلونی باكتریها در محیط عمومی   دانستیه تعداد كلونیها
زمان ( برحسب فوت مربع در ساعت (برحسب فوت مربع در دقیقه) تعداد پلیت‌ها باكتری
تعدادكلونی قارچها در محیط كشت اختصاصی   دانستیه تعداد كلونیها
تعداد كل كلونیها در محیط عمومی  

 

تعداد باكتریها در پلیت N . A

(فوت مربع در ساعت)

 
تعداد قارچها در S. D. A

(فوت مربع در ساعت)

 
تعداد باكتریها و قارچها در N . A

(فوت مربع در ساعت)

 

ترجمه: یك پلیت خوب تعداد كلونی رنگی متفاوت خواهد داشت. دقت كنید به ویژگیهای كركی طبیعی از كلونیها. بعلاوه نگاه كنید به كف بطری و كلونیهایی با صورت رنگی متفاوت مشاهده كنید. شناختن آنها بر اساس رنگ ظاهری، رنگ پنهان، ساختار گسترش و دیگر مشخصات الپورها می‌باشد. شكل 4-7 نشان دهنده مشخصات مشترك رشد بروز یافته است هنگامی كه در محیط كشت
Bourzvd’s Agar تلقیح می‌شوند. در هنگام بهره‌برداری از شكل 4-7 توجه كنید مشخصه كلونی می‌تواند تغییر كند به طور محسوس در زمان بیشتر. تصاویر شكل 4-7 كلونیهای 10 تا 12 روزه است. مشخص كردن و شناخت قطعی نمی‌شود الا اینكه اسلاید میكروسكوپی ساخته شود كه تیپ و نوع شخصیت اسپورها را تشخیص دهد. شكل 4-7 به شكل نموداری تفاوتهای میكروسكوپی كه قابل مشاهده است را مورد توجه قرار داده است.

دو انتخاب : در هنگام ساختن اسلاید از انواع كلونیها می‌توان مستقیماً از قسمت مطلوب مركز كلونی موجود ایجاد شده برداشت یا اسلایدها را به روش ذكر شده در تمرین 23 ساخت. برای ساختن اسلایدهایی كه به طور مستقیم از كلونیها ساخته می‌شود بایستی مراحلی را انجام داد. معلم شما به تعدادی كه بایستی ساخته شود اشاره خواهد كرد.

موارد :

تجمع ساختی روی سابرود آگار

اسلایدهای میكروسكوپی و لامل ( شیشه ) پوششی

لاكتوفنل پنبه‌ای آبی لكه‌ای

اسكالپل‌های نوك دار و تیز یا سوزنهای شكافنده

1- پلیت های سرباز را در استج میكروسكوپ خود قرار دهید و لبه یك كلونی رنگی را با عدسی كم با قدرت كم مورد بررسی قرار دهید ساختار افقی و ترتیب اسپورها را جستجو كنید. كلونیهای سفید را نادیده بگیرید زیر آن‌ها بطور كلی كمبود اسپور دارند و تشخیص آنها مشكل می‌باشد.

2- به شكل 4-7 و 5-7 مراجعه كنید و یك شناسایی مقدماتی بر اساس ویژگیهای كلونی و بزرگنمایی با قدرت پایین در خصوص هیف و اسپور به عمل آمدید.

3- یك اسلاید مرطوب را با اضافه كردن مقدار كمی محیط كشت بر یك قطره آبی پنبه‌ای جهت بررسی بسازید. و یا یك شیشه لامل بپوشانید و زیر میكروسكوپ كم قدرت و خیلی خشك مورد بررسی قرار دهید. مجدداً به شكل 5-7 رجوع كنید تا هم نتایج ناشی از آزمایشات قبلی لبه كلونی تایید شود.

4- روش بالا را برای كلونی‌های مختلف تكرار كنید.

گزارش آزمایشگاهی:

بعد از ثبت نتایج خود در گزارش آزمایشگاهی به همه سئوالات جواب دهید.

برای دیدن قسمت های دیگر این تحقیق لطفا” از منوی جستجوی سایت که در قسمت بالا قرار دارد استفاده کنید. یا از منوی سایت، فایل های دسته بندی رشته مورد نظر خود را ببینید.

لینک متن کامل

Leave a comment