سایت دانلود

تحقیق ها مقاله ها و پایان نامه ها
محیط زیست

گزارشات آزمايشات ميكروبيولوژي محيطي – قسمت دوم

 

لاكتوفنل كاتن بلو

براي رنگ آميزي لاملها يك قطره رنگ آميزي مخصوص قارچها ( لاكتوز فنل كاتن بلو) كنار دست گذاشته و در كنار شعله پليت را روي سكو قرار مي‌دهيم و گوشه پليت را باز كرده و با پنس يك ضربه كوچك به داخل زده و با همان پنس لامل را برداشته و از سمتي كه ميسليوم به لام چسبيده داخل رنگ مي‌گذاريم و 20 تا 30 ثانيه صبر مي‌كنيم و لام را زير ميكروسكوپ قارچ مورد نظر مطالعه مي‌كنيم. پس از مشاهده زير ميكروسكوپ و تطبيق آن با جدول پيوست مشاهده گرديد كه مودر شماره 14 Oospora يا Ceotvichum در زير لامل رشد نموده است.

نکته مهم : برای استفاده از متن کامل تحقیق یا مقاله می توانید فایل ارجینال آن را از پایین صفحه   کنید. سایت ما حاوی تعداد بسیار زیادی مقاله و تحقیق دانشگاهی در رشته های مختلف است که می توانید آن ها را به رایگان   کنید

عنوان آزمايش: مرحله تاييدي MPN

هدف: تاييد يا عدم تاييد وجود آلودگي در نمونه، آبي

در اين مرحله از محيط كشت‌هاي اختصاصي از EMB استفاده مي‌كنيم كه اختصاصي و هم افتراقي است دليل اختصاصي‌ايي است كه باكتريهاي G+ اجازه رشد نداده و مخصوص G- هاست و به اين دليل افتراقي است كه كلونيهاي را تشكيل مي‌دهند تا نسبتاً بزرگ، شل و آبكي و يك مركز تيره رنگ دارند و از همه مهمتر اينكه اگر خود E.Coil باشد تصوير رنگ سبز جلاي فلزي درخشان مي‌باشد در صورتي كه در ساير باكتريها اين طور نيست.

  • qتعيين Fecal Coliform

روش عمل: در اين مرحله به تعداد لوله‌هاي مثبت شده لوله آزمايش انتخاب كرده و در آن محيط كشت E.C.Broth داخل آن قرار داده و روي سه لوله اول كه براي سه لوله مثبت شده مورد نظر قرار داده و عدد 10 را ثبت مي‌كنيم و براي دو لوله بعدي كه براي لوله‌هاي مثبت شده سه لوله دوم در نظر گرفته مي‌شود عدد 1 ثبت مي‌كنيم و در كنار شعله و در شرايط ستورن در كنار شعله با استفاده از لوپ به شرح فوق در لوله‌ها تلقيح مي‌كنيم و در دماي به مدت 24 ساعت در انكوباتور گرماگذاري مي‌كنيم.

طبق مشاهده و قرائت نتيجه 3     1   0

در صد ميلي ليتر نمونه وجود دارد 10 = 45 ×4.5

عنوان آزمايش: مرحله تكميلي MPN

هدف: مشاهده تفكيكي كلي فرمها

در اين مرحله دو تا از لوله‌هاي مثبت شده مرحله قلا مرحله تاييدي را انتخاب كرده و با كمك لوپ روي دو تا محيط كشت يكي كشت مجدد از كلوني‌هايي كه بزرگ بوده و مركز تيره دارند كه اين كشت در لوله حاوي L . B صورت مي‌گيرد و لوله دوم كه در لوله شيب دار N.A از كلونيهاي داراي مشخصات كلي فرمي تلقيح مي‌كنيم پس آنها را به مدت 24 ساعت در درجه حرارت گرما گذاري مي‌كنيم در مشاهده اسمير تهيه شده و رنگ آميزي شده از محيط NA با سيلهاي گرم منفي بدون اسپور () تاييد گرديد.

اثر شياكلي داراي مشخصات: لزج، جلاي فلزي، كلوني كوچك مي‌باشد.

در پايان مرحله تكميلي اگر هدف شناسايي باكتري با استفاده از محيط شيب دار مورد نظر باشد وارد تستهاي بيوشيميايي مي‌شويم. براي اين تستها بايستي كشت خالص داشته باشيم ( حداقل دو گونه باكتري ) اگر خالص نباشد تستهاي بيوشيمايي با كليد راهنما نمي‌تواند تستهاي بيوشيميايي با روش IMViC انجام مي‌شود.

عنوان آزمايش: روش صافي غشايي

هدف: تعيين آلودگي آب

در استفاده از روش ضافي غشايي از صافي‌هايي استفاده مي‌شود كه قطر منافذ آنها از قطر باكتريها كمتر است وقتي نمونه مورد نظر از صافي بگذرد باكتريها روي ضافي را اگر روي پليت حاوي محيط كشت بگذاريم رشد خواهد كرد.

در اين روش از دستگاه ويژه‌اي استفاده مي‌شود كه شامل سه قسمت مي‌باشد يكي قيف كه فيلتر در درون آن قرار مي‌گيرد دوم پايه نگهدارنده و ارلن خلأ يا تخليه كه با يك شلنگ به پمپ خلأ وصل مي‌شود كه به غير از پمپ ساير اجزاء بايستي استريل باشد براي اين كار قبلاً با يك تكه آلومينيوم كاغذ فويل آلومينيومي مي‌پوشانيم و همه اجزاء را داخل اتوكلا قرار مي‌دهيم و نزديك شعله پس از استريل كردن بر روي هم سوار مي‌كنيم. البته بهتر است فيلتر را داخل گذاشته و سپس استريل كنيم پوشش روي آن را وقتي بر مي‌داريم كه خواهيم آب را صاف كنيم. اگر آب كدورت بالايي داشته باشند ما مجبور به روشن كردن پمپ مي‌باشيم پس از اين مرحله آب داخل ارلن را جمع مي‌كنيم و در كنار شعله اجزاي دستگاه را جدا مي‌كنيم و پنس را داخل الكل قرار داده و كنار شعله استريل كرده و فيلتر را برداشته و به همان شكل داخل محيط كشت قرار داده و در داخل اتكوباتور به مدت 25 ساعت در دماي گرماگذاري مي‌كنيم براي اين روش معمولاً محيط كشتي را انتخاب مي كنيم كه نيمه جامد بوده و آثار كمتري داشته باشد كه سريعتر جذب فيلتر شود. اگر باكتريها واقعاً وجود داشته باشند پس از 24 ساعت گرماگذاري روي فيلتر كلي فرمها قابل مشاهده و شمارش هستند البته حجم آب بايستي مشخص باشد. روش صافي سريعتر از روش MPN مي‌باشد بدين صورت كه در روش صافي غشايي تا 24 ساعت نتيجه مشخص مي‌شود در صورتي كه در روش MPN سه تا چهار روز نتيجه طول مي‌كشد. فايده روش ضافي سرعت عمل آن مي‌باشد و عيب آن اين است كه در مورد آبهاي تصفيه شده راحت مي‌باشد ولي در مورد آب رودخانه كه هم كه مدت و هم تنوع باكتريها بالاست ممكن است سطح فيلتر براي باكتري مناسب باشد و يا نامناسب بوده و پاره مي‌شود كه البته متداولترين روش براي آبهاي تصفيه شده است.

عنوان آزمايش: تست IMViC

هدف: تشخيص باكتريهاي اشر شياكلي، انتروباكتر و كلبسيلا در آب آلوده نمونه

ويژگيهاي درون سلول يعني توانايي متابوليسمي و آنزيمي سلول چون جنسهاي مختلف و گونه‌هاي مختلف واكنشهاي متابوليسمي متفاوتي دارند مثلاً حتي يك جنس واحد يك گونه مي تواند از يك ماده غذايي خاص استفاده كند ولي اگر نتواند يك گونه ديگر است.

راه تشخيص: همان اتفاقي كه در درون سلول مي‌افتد با استفاده از مواد شيميايي به نوعي قابل مشاهده كنيم.

تفاوت آنزيمها را به تستهايي كه تستهاي بيوشيميايي گفته مي‌شود اندازه‌گيري و مشخص مي‌كنند مثلاً اگر ميكروارگانيسمي اليه توليد كند مي‌توان از راه سنجش PH آن را اندازه‌گيري كرد.

در مورد كلي فرمها يك باكتري مجهول را شناسايي و در اولين كار رنگ آميزي G مي‌كنيم اگر G+ باشد شامل كوكي و با سيل و G- شامل كولي و باسيل مي‌باشد باسيل G- از خانواده كلي فرمسهاست. يك آزمايش اختصاصي بيوشيميايي G- باسيل وجود دارد كه به آن آزمون IMViC گفته مي‌شود كه اختصاصي كلي فرمهاست. چهار تست شيميايي مجموع IMViC را تشكيل مي‌دهند كه براي تشخيص جنس و گونه‌هاي كلي فرمها به كار مي‌رود. اين تست براي شناسايي تمام جنس اين گونه ها و خانواده‌ها كافي نيست اما باكتري كه مورد نظر و جستجوي ماست يكي از سه باكتري 1- اشر شياكلي E-Coli 2- انتروباكتر E.Bacter 3- كلبسيلا مي‌باشد كه هر سه باكتري روده‌اي و از مهمترين كلي فرما هستند. اين تست براي تشخيص اين سه گونه كفايت مي‌كند بخصوص جواب اين آزمون براي جستهاي انتروباكتروكلبسيلا كاملاً يكسان است به همين خاطر بر اساس آزمون IMViC و به خاطر قشا به در يك گروه به نام گروه انتروباكتركلبسيلا ناميده مي‌شود كه اگر بخواهيم جداسازي بكنيم بايستي سراغ تستهاي ديگري برويم.

روش كار قسمت IMViC :

1) بررسي توانايي استفاده ايندول سلول توسط باكتري از اسيد آمينه تريپتوفان استفاده مي‌شود براي اين امر از معرف شيميايي به نام كواكس استفاده مي‌كنيم كه اگر اندول وجود داشته باشد تركيب شده و رنگ قرمز رنگ توليد مي‌كند و اگر وجود نداشته باشد تغيير رنگ نداده و زرد رنگ است.

اساس كار به اين صورت است كه در محيط كشت SIM(A) كه نيمه آگار است به صورت عمقي در داخل لوله باكتري مورد نظر را به شكل عمقي با كمك سوزن در امتداد يك خط به شكل عمقي كشت مي‌دهيم و به مدت 24 ساعت در دماي در داخل انكوباتور گرماگذاري مي‌كنيم و پس از آن 10-5 قطره معرف كواكس را روي آن مي‌ريزيم و 15 دقيقه صبر مي‌كنيم اگر مثبت باشد قرمز هاله‌اي تشكيل مي‌شود و اگر منفي باشه هاله زرد رنگ مي‌باشد. ] پس از انجام مشاهده شد كه قرمز شده است.[

2) آزمون بعدي (M) متيل رد مي‌باشد كه دو تا تست در اين آزمون انجام مي‌دهيم كه با استفاده از يك محيط كشت باشد اين محيط كشت مايع MRVP مي‌باشد كه وجود مواد كه بني و قندي در آن كه تعدادي از باكتريها مي‌توانند اين مواد را معرف و مقدار زيادي رسيد توليد كنند و PH محيط را تا 4 – 4.5 پايين بياورند. معرف متيل رد را كه اسيدي است قرمز رنگ مي‌كند كه نشانگر وجود باكتري است. اگر تركيبات كربن دار هم معرف شوند PH = 4.5 و متيل رد قرمز رنگ مي‌شود ولي اگر كم مصرف شود PH=6 و متيل رد زرد به رنگ چركي مي‌شود درجه حراست و به مدت 24 ساعت براي گرماگذاري در اين مرحله لازم است. ] پس از انجام مشاهده شد كه قرمز رنگ شده است [.

3) لوله دوم در آزمون بعدي آزمون تست VP همان باكتري را در همان محيط كشت مي‌دهيم و بعضي باكتريها تمام قند موجود در محيط را نمي‌توانند مصرف كنند و ساير تركيبات را مصرف مي‌كنند و از جمله فرآورده‌هايي را كه توليد مي‌كنند استيل متيل كابينول مي‌باشد اين ماده اگر با يك ماده شيميايي به نام باريت تركيب شود يك رنگ قرمز ايجاد مي‌كند اما اگر در محيط نباشد تقريباً‌ زرد چركي ايجاد مي‌شود. اساس كار در اين مرحله اضافه كردن معرف پس از گرماگذاري 24 ساعته در درجه حرارت مي‌باشد كه ابتدا 10 قطره محلول A و پس از يك الي دو دقيقه هم زدن 10 قطره محلول B را اضافه مي‌كنيم و هم مي‌زنيم تا تركيب شود سپس 15 دقيقه صبر مي‌كنيم كه اگر رنگ قرمز رنگ شود VP مثبت است ولي اگر زرد رنگ شود VP منفي است ] پس از انجام مشاهده شد كه رنگ زرد مي‌باشد.[

4) در مرحله چهارم از محيط كشت خامي به نام سيمون سيترات آگار (SCA) كه سبز رنگ مي‌باشد استفاده مي‌شود كه يك محيط كشت اختصاصي و تنها ماده كربني و انرژي موجود در آن سيترات سديم مي‌باشد. بعضي از باكتريهاي مورد جستجو مي‌توانند سيترات سديم را به عنوان تنها منبع تغذيه‌اي استفاده كنند پس رشد مي‌كنند اما اگر باكتري داشته باشيم كه نتواند آن را استفاده كند نمي‌تواند رشد كند كه راه تشخيص الف) تشكيل كلوني. ب) توليد تركيبات اسيدي كه رنگ محيط كشت را عوض مي‌كند و اگر رشد كند رنگ محيط را آبي مي‌كنند ولي اگر رشد نكنند رنگ محيط كشت تغييري نكرده و سبز مي‌ماند در اين مرحله كه احتياجي به معرف براي تشخيص نهايي نمي‌باشد به مدت 24 ساعت در دماي گرماگذاري پس از تلقيح لازم است ( معرف موجود در داخل محيط كشت برموتيمول بلو است).

در پايان مراحل IMViC

D       M       VP     C

+       +         -         -

و با توجه به مثبت بودن I باكتري مورد نظر رشد شياكلي تشخيص داده شد.

( اگر انتروباكتروكلبسيا باشد

I      M       VP     C

-       -         +       +

عنوان آزمايش: تعيين دانستيه ميكروبي هوا

هدف: تعيين ميازن تراكم باكتريها و قارچها در هواي يك محيط بسته هوا زيستگاه هيچ ميكروارگانيسمي نيست چون شرايط زيستي شامل رطوبت ثابت مواد غذايي و عدم تغيير و تحول كافي نمي‌باشد اما مهترين محيط نقل و انتقال ميكروارگانسم‌ها مي‌باشد كه براي تعيين كارآمدي سيستم‌هاي تهويه در محيط‌هاي بسته مثل بيمارستانها استفاده مي‌شود.

محل مورد آزمايش نبايد آقتاب گير بوده و در معرض جريان باد كولر يا بخاري باشد و حداقل نيم متربا با زمين فاصله داشته باشد. با رعايت شرايط فوق مهل روي ميز آزمايشگاه در نظر گرفته شد و درب پليت‌ها (دوپليت‌ها) را به مدت 30 دقيقه كه يكي حاوي محيط كشت N .A مي‌باشد كه محيط كشت مشترك باكتريها و قارچها مي‌باشد و يكي حاوي محيط كه محيط كشت مشترك باكتريها و قارچها مي‌باشد و يكي حاوي محيط كشت N . A مي‌باشد كه محيط كشت مشترك باكتريها و قارچها مي‌باشد يكي حاوي محيط كشت SDA كه اختصاصي براي قارچها مي‌باشد را باز مي‌گذاريم. به اين دليل بيشتر از 30 دقيقه باقي نمي‌گذاريم كه آب محيط كشت تبخير مي‌شود. پس از اين مرحله هر دو محيط كشت را به مدت 24 ساعت و در دماي گرماگذاري مي‌كنيم.

براي تعيين باكتريها و قارچها از فرمول‌هاي خاصي استفاده مي‌شود:

تعدادكلوني باكتريها در محيط عمومي دانستيه تعداد كلونيها
زمان ( برحسب فوت مربع در ساعت (برحسب فوت مربع در دقيقه)تعداد پليت‌هاباكتري
تعدادكلوني قارچها در محيط كشت اختصاصي دانستيه تعداد كلونيها
تعداد كل كلونيها در محيط عمومي 

 

تعداد باكتريها در پليت N . A

(فوت مربع در ساعت)

 
تعداد قارچها در S. D. A

(فوت مربع در ساعت)

 
تعداد باكتريها و قارچها در N . A

(فوت مربع در ساعت)

 

ترجمه: يك پليت خوب تعداد كلوني رنگي متفاوت خواهد داشت. دقت كنيد به ويژگيهاي كركي طبيعي از كلونيها. بعلاوه نگاه كنيد به كف بطري و كلونيهايي با صورت رنگي متفاوت مشاهده كنيد. شناختن آنها بر اساس رنگ ظاهري، رنگ پنهان، ساختار گسترش و ديگر مشخصات الپورها مي‌باشد. شكل 4-7 نشان دهنده مشخصات مشترك رشد بروز يافته است هنگامي كه در محيط كشت
Bourzvd’s Agar تلقيح مي‌شوند. در هنگام بهره‌برداري از شكل 4-7 توجه كنيد مشخصه كلوني مي‌تواند تغيير كند به طور محسوس در زمان بيشتر. تصاوير شكل 4-7 كلونيهاي 10 تا 12 روزه است. مشخص كردن و شناخت قطعي نمي‌شود الا اينكه اسلايد ميكروسكوپي ساخته شود كه تيپ و نوع شخصيت اسپورها را تشخيص دهد. شكل 4-7 به شكل نموداري تفاوتهاي ميكروسكوپي كه قابل مشاهده است را مورد توجه قرار داده است.

دو انتخاب : در هنگام ساختن اسلايد از انواع كلونيها مي‌توان مستقيماً از قسمت مطلوب مركز كلوني موجود ايجاد شده برداشت يا اسلايدها را به روش ذكر شده در تمرين 23 ساخت. براي ساختن اسلايدهايي كه به طور مستقيم از كلونيها ساخته مي‌شود بايستي مراحلي را انجام داد. معلم شما به تعدادي كه بايستي ساخته شود اشاره خواهد كرد.

موارد :

تجمع ساختي روي سابرود آگار

اسلايدهاي ميكروسكوپي و لامل ( شيشه ) پوششي

لاكتوفنل پنبه‌اي آبي لكه‌اي

اسكالپل‌هاي نوك دار و تيز يا سوزنهاي شكافنده

1- پليت هاي سرباز را در استج ميكروسكوپ خود قرار دهيد و لبه يك كلوني رنگي را با عدسي كم با قدرت كم مورد بررسي قرار دهيد ساختار افقي و ترتيب اسپورها را جستجو كنيد. كلونيهاي سفيد را ناديده بگيريد زير آن‌ها بطور كلي كمبود اسپور دارند و تشخيص آنها مشكل مي‌باشد.

2- به شكل 4-7 و 5-7 مراجعه كنيد و يك شناسايي مقدماتي بر اساس ويژگيهاي كلوني و بزرگنمايي با قدرت پايين در خصوص هيف و اسپور به عمل آمديد.

3- يك اسلايد مرطوب را با اضافه كردن مقدار كمي محيط كشت بر يك قطره آبي پنبه‌اي جهت بررسي بسازيد. و يا يك شيشه لامل بپوشانيد و زير ميكروسكوپ كم قدرت و خيلي خشك مورد بررسي قرار دهيد. مجدداً به شكل 5-7 رجوع كنيد تا هم نتايج ناشي از آزمايشات قبلي لبه كلوني تاييد شود.

4- روش بالا را براي كلوني‌هاي مختلف تكرار كنيد.

گزارش آزمايشگاهي:

بعد از ثبت نتايج خود در گزارش آزمايشگاهي به همه سئوالات جواب دهيد.

برای دیدن قسمت های دیگر این تحقیق لطفا" از منوی جستجوی سایت که در قسمت بالا قرار دارد استفاده کنید. یا از منوی سایت، فایل های دسته بندی رشته مورد نظر خود را ببینید.

لینک متن کامل

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *